胰蛋白酶的制備及活力的測定(2)
三、儀器
食品加工機和高速分散器；研缽；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽濾瓶；紗布；恒溫水浴；紫外分光光度計；秒表；pH試紙。
操作方法
一、豬胰蛋白酶制備
（一）豬胰蛋白酶原的提取
豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結締組織后，絞碎。
加入2倍體積預冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃攪拌提取24小時，四層紗
布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調pH至2.5～3.0，放置3～4小時后用折迭濾紙過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。
加入固體硫酸銨（予先研細），使溶液達0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過
夜后抽濾（擠壓干），得豬胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活
向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計）冷的蒸餾水，使濾餅溶
解，得胰蛋白酶原溶液。將研細的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計），使 Ca2+與SO42-結合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中最終仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH調pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時，（2～3小時取樣一次，并用0.001M HCl稀釋），測定酶活性增加的情況。
3．活化完成（比活約3500～4000BAEE單位）后，用2.5M H2SO4調pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分離
1．將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細粉狀固體硫酸銨，使溶液達到0.4飽和度，放置數小時后，抽濾，棄去濾餅。
2．濾液按250克/升加入研細的硫酸銨，使溶液飽度達到0.75，放置數小時，抽濾，棄去濾液。
（四）胰蛋白酶的結晶
1．將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進行結晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計加入緩沖液，小心攪拌溶解。
2．用2M NaOH調pH至8.0，注意要小心調節，偏酸不易結晶，偏堿易失活，存放于冰箱。3．放置數小時后，應出現大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態分散，必要時加入少許胰蛋白酶晶體。
4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結晶，待結晶析出完全時，抽濾，母液回收。
（五）胰蛋白酶的重結晶
將第一次結晶的胰蛋白酶產物進行重結晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0
的0.8M硼酸緩沖液，至結晶酶全部溶解，取樣后，用2M
NaOH調溶液pH至8.0（準確）（體積過大，很難結晶），冰箱放置1～2天，可將大量結晶抽濾得第二次結晶產物(母液回收)，冰凍干燥后得重結晶的豬胰蛋白酶。
二、胰蛋白酶活性的測定
以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物，用紫外吸收法進行測定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長
253nm下的紫外吸收遠遠弱于苯甲酰L—精氨酸（英文縮寫為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應體系的紫外吸收宜隨之相應增加。
取2個光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25℃予熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L
HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點。再在另一比色杯中加入0.2ml待測酶液（用量一般為10微克結晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時，每半分鐘讀數一次，共讀3~4分鐘。控制DA253/min
在0.05 ~ 0.100左右為宜。
繪制酶促反應動力學曲線，從曲線上求出反應起始點吸光度隨時間的變化率（即初速度）DA253/min。
胰蛋白酶活力單位的定義規定為：以BAEE為底物反應液pH8.0，25℃，反應體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測定DA253，每分鐘使DA253增加0.001，反應液中所加入的酶量為一BAEE單位。
胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ mL）＝
胰蛋白酶比活力（BAEE單位 / mg ）＝
注意事項
（1）胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導致實驗失敗。
（2）在室溫14～20℃條件下8～12小時可激活完全，激活時間過長，因酶本身自溶而會使比活降低，比活性達到 “3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時即可停止激活。
（3）要想獲得胰蛋白酶結晶，在進行結晶時應十分細心地按規定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養結晶也較容易，因此每一步操作都要嚴格。酶蛋白溶液過稀難形成結晶，過濃則易形成無定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來說待結晶的溶液開始時應略呈微渾濁狀態。
（4）過酸或過堿都會影響結晶的形成及酶活力變化，必須嚴格控制PH。
（5）第一次結晶時，3～5天后仍然無結晶，應檢查pH，必要時調整pH或接種，促使結晶形成。重結晶時間要短些。
-
產品技術
-
技術原理
