一、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank's平衡鹽/DMEM溶液，無Hepes）培養基中，除去腦膜和血管、海馬、尾核和其他非皮層組織。
二、 用解剖刀將其切成1 mm3大小的組織塊。
三、用1ml槍頭轉移250 ul?膠原酶儲存液（1.33%，溶于L-15中）到1 ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液。
四、37℃水浴中孵育30 min。
五、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。
六、去上清。
七、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根據觀察到的細胞消化的情況，適當調整兩者的比例。
八、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘。
九、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。
十、去上清。加入500 ul D-MEM-BS。
十一、輕輕吹打成單細胞懸液，開始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時用18-gauge的針頭吹打。( 注意：不要產生氣泡。）200目/300目尼龍網過濾。
十二、將細胞轉移到含10%FCS-DMEM的培養瓶中，培養密度為2X106/25 cm2培養瓶，4～6 X106/75 cm3培養瓶。在37.2℃，37.5%中培養。
十三、第2天換液，以后每隔3天換液。
十四、7-10天，細胞發生融合。
十五、細胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養，旋轉速度以不產生氣泡為宜。37℃振搖過夜。細胞注意避光。
十六、去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM。
十七、加入200 ul 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養基。在37.2℃，37.5%中培養孵育48小時以消除分裂的細胞。
十八、換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復24小時。
十九、重復17-18步驟，消除所有的分裂細胞。 展開 | 
