蛋白質胰蛋白酶磷酸肽圖譜制定實驗
?實驗方法原理
實驗材料 含 32P 標記的蛋白質的樣品
試劑、試劑盒 熒光墨水／染料碳酸氫銨2-巰基乙醇SDS載體蛋白（溶于去離子水中）三氯乙酸（TCA）乙醇過氧化氫甲酸TPCK-處理的胰蛋白酶（溶于去離子水／ HCl ）電泳緩沖液綠色標記染料層析緩沖液
儀器、耗材 單邊剃刀刀片／手術刀片閃爍計數器1.7 ml 微量離心管一次性的組織研磨件搖床臺式離心機纖維素薄層色譜板小體積可調移液器由韌性塑料制成的一次性長吸頭帶濾器的空氣管HTLE 7000 電泳裝置聚乙烯膜 電泳芯子層析缸風扇65℃ 烘箱
實驗步驟
實驗試劑儀器的具體要求和準備見「其他」。
1. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離含有 32P 標記的蛋白質樣品。
2. 電泳后，干膠，四周邊緣用熒光墨水標記，對 X 射線膠片曝光（放射自顯影）。
3. 通過與膠片上的凝膠四周熒光標記的位置的比對確定蛋白質的位置。將膠片與干膠釘在一起，膠片朝下放入一個光盒里。在膠的背面用軟鉛筆或圓珠筆（不要用標簽筆）標記出 32P 標記蛋白質條帶的位置。
4. 將干膠與膠片分離開，用單邊剃刀刀片從膠上割下蛋白質條帶。從割下的膠條上剝去紙片并用刀片輕輕刮去殘留的紙屑。盡量不要削掉凝膠，因為這會減少蛋白質的回收。將膠條放到 1.7 ml 帶螺旋蓋的微量離心管中，用閃爍計數器進行契侖科夫計數以測定放射量。
5. 將干的膠條重新浸入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 7.3～7.6 中，于室溫下放置 5 min。用 Kontes 組織研磨杵搗碎膠條，直至管子對著光看不到膠塊時為止。加入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 7.3～7.6，10 μl 2-巰基乙醇和 10～20% SDS，煮 2～3 min。
6. 在搖床上于室溫下搖蕩 4 h 或于 37℃ 至少搖蕩至少 90 min 以提取蛋白質。
7. 用帶吊桶式轉子的臺式離心機于室溫下 500 g 離心 5 min 收集管底的凝膠漿。上清移至新的 1.5 ml 微量離心管中。
8. 在開始第二次洗脫前，測量第一次洗脫液的體積并計算出第二次洗脫的液體量，以使兩次洗脫液合并在一起的總量約為 1300 μl。第二次洗滌時，按計算出的量加入 50 mmol/L 碳酸氫銨，內含 0.1% SDS 和 1.0% 2-巰基乙醇。渦旋振蕩，煮 2～3 min，然后在搖床上孵育至少 90 min 進行再次提取。
9. 按照步驟 7 的方法離心分離凝膠和洗脫液，將上清液轉移到裝有初次洗脫液的管子中。
10. 為了除盡合并的洗脫液中的凝膠漿，全速離心 5～10 min，將上清液轉移到新的管子中。在丟棄凝膠碎片前，用契侖科夫計數法進行檢測以確保有 60%～90% 的 32P 標記蛋白被回收。
11. 將洗脫液放置在冰上冷卻。加入 20 μg 載體蛋白（10 μl 2 mg/ml 的儲液），充分混勻，加入 250 μl 冰冷的 100% TCA，充分混勻，冰上孵育 1 h。
12. 于 4℃ 全速離心 5～10 min 收集蛋白質沉淀。棄上清液，再次于 4℃ 離心 3 min，去除殘留的 TCA。
13. 加入 500 μl 冰冷的 96% 乙醇顛倒管子幾次洗滌 TCA 沉淀，于 4℃ 全速離心 5 min，棄上清液，再次于 4℃ 離心 3 min，去除殘留液體。晾干蛋白質沉淀（不要凍干）。
14. 用契侖科夫計數法對沉淀進行檢測以確保大部分的 32P 標記蛋白被回收。
此時樣品的 cpm 值應當與洗脫液（見步驟 10）的 cpm 值相同或稍微高一些，因為洗脫液的液體會碎滅減少計數。
15. 制備過甲酸：將 9 份甲酸與 1 份 30% 過氧化氫混合，于室溫下孵育 60 min。將過甲酸放置于冰上冷卻。
16. 將 TCA 沉淀的蛋白質重懸于 50 μl 冰冷的過甲酸中，冰上孵育 60 min。
17. 加入 400 μl 去離子水，混勻，放置于干冰上冷凍。在 SpeedVac 蒸發器中真空蒸發掉過甲酸。
18. 將蛋白質沉淀重溶于 50 μl 50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 8.0, 加入 10 μg 胰蛋白酶（10 μl 1 mg/ml 的儲液）， 37℃ 消化 3～4 h 或過夜。
19. 再加入 10 μg 胰蛋白酶，再次于 37℃ 消化 3～4 h 或過夜。
20. 加入 400 μl 去離子水，在 SpeedVac 蒸發器中凍干。將干粉重溶于 400 μl 去離子水中并再次凍干。如此重復，至少要凍干 4 次。
21. 將胰蛋白酶消化的產物重溶于 400 ul 電泳緩沖液或去離子水中。
22. 全速離心 5～10 min 去除肽混合溶液中的顆粒物質，將上清液轉移到一個新的微量離心管中，凍干。用契侖科夫計數法測量最終樣品的 32P 放射量。
23. 用至少 5 μl 的 pH 1.9 的電泳緩沖液、pH 4.72 的電泳緩沖液或去離子水，重新溶解消化產物，全速離心 2～5 min 收集管底的樣品溶液。
24. 用超軟的鈍頭鉛筆在 TLC 平板的纖維素側劃小叉標記出樣品和染料起始點（圖 17.9.1），注意不要擾動纖維素層（或者也可以選擇在反面用記號筆做標記）。
25. 用裝有長而柔韌吸頭（圓的，凝膠上樣吸頭很好用）的小體積可調移液器，將各個樣品（1000 cpm）點到相應的起始點上。每滴點 0.2 ～0.5 μl，吹干后再點下一滴，可以用帶濾器（濾掉浮質及顆粒物質）的氣管和 1 ml 注射器或巴斯德吸管吹干所點的樣品。
26. 在板的頂端的染料起始點上滴加 0.5 μl 綠色標記液（圖 17.9.1 和圖 17.9.2）。
27. 如下準備 HTLE 7000 裝置，參見圖 17.9.3。
27.1 將電泳緩沖液倒入緩沖液缸中，約 5 cm 深。在 Teflon 蓋子上放一張聚乙烯膜以保護并隔絕底座，膜的兩端折下塞入底座和緩沖液缸之間，將膜固定。
27.2 在電泳緩沖液中浸濕電泳芯子，將芯子的一邊塞入緩沖液缸中，折起另一邊放在底座上的聚乙烯膜上。再取一張聚乙烯膜放于底座、電泳芯子和部分緩沖液缸上。
27.3 在頂上放第二張 Teflon 膜和氯丁橡膠墊，封閉裝置，用兩個銷子固定蓋子。將氣壓調至 10 psi 使氣袋膨脹以從電泳芯子中擠出多余的緩沖液。保持氣壓直到開始電泳為止。
27.4 當樣品點到 TLC 平板（步驟 25 和 26）并準備開始電泳時，關閉氣壓并打開裝置。除去氯丁橡膠墊和頂端的 Teflon 膜及聚乙烯膜，折回電泳芯子。用綿紙擦干兩張聚乙烯膜。
27.5 按照圖 17.9.2 浸濕含有樣品的 TLC 平板并將之放于覆蓋底座的聚乙烯膜上。將兩側的電泳芯子分別蓋在平板的邊上約 1 cm 寬，然后按照上述操作小心地重新搭好裝置。聚乙烯膜與 TLC 板接觸后，要避免其側移。用銷子固定蓋子，使氣袋膨脹至 10 psi , 打開冷卻水流，開始電泳。
27.6 以 1.0 kV 電壓電泳 20～30 min，在一維方向上分離肽（圖 17.9.2）。
28. 電泳完成后，拆除裝置，用風扇吹干 TLC 平板，至少吹 30 min。
29. 在平板的左手邊或右手邊的邊緣與樣品起始點齊平的位置點上一滴（約 0.5 ml） 綠色標記染料，避免滴加到被電泳芯子接觸擠壓過的區域（圖 17.9.4）。將干的平板近乎豎直地放置到裝有合適的層析緩沖液的層析缸中，蓋上蓋子。在層析進行時切勿擾動層析缸或打開蓋子。使緩沖液跑到距離平板頂端 1～2 cm 處。
30. 打開層析缸，將 TLC 平板從層析缸中取出。使平板在通風櫥中干燥 1 h 或在 65℃ 烘箱中干燥 15 min。
31. 用熒光墨水在平板四周做標記，這些參照標記有助于以后的放射自顯影圖片與TLC 平板的比對。在增感屏的輔助下將平板對 X 射線膠片或磷屏曝光以進行放射自顯影。如果需要回收肽以備進一步的分析的話，參見輔助方案。
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注意事項
1. 特別注意：管子的品牌非常重要。應當選用不會產生副作用或在最后轉移一步中吸附太多 cpm 的管子。作者使用的是 Myriad Industries 的微量離心管。
2. 步驟 17 中，非常重要的一點是稀釋并冷凍后再進行蒸發，否則，SpeedVac 蒸發器中溫度的升高會使樣品酸水解。
這時可以取一份樣品（5%～10% 的消化物，至少 200 cpm）進行磷酸氨基酸分析。進行凍干和后續操作。
3. 步驟 22 中，非常重要的一點是最終的樣品溶液中不能有顆粒物質存在，為了確保這一點可以重復幾次這一步的離心操作。
4. 步驟 26，標記染料呈綠色，但在電泳時能分離出藍色（二甲苯藍 FF）和黃色（edinitrophenyllysine）的成分（圖 17.9.2D）。
5. 在步驟 27.5，作者利用起始點周圍帶孔的吸水紙來使電泳緩沖液浸濕 TLC 平板以盡量使樣品集中（圖 17.9.1 和圖 17.9.2）。吸水紙是由兩層 Whatman 3 MM 濾紙沿著邊緣縫合在一起做成的。用鋒利的軟木塞打孔器在圍繞起始點的位置（圖17.9.1）打出 1.5 cm 的孔。最好每種 緩沖液分別用各自的吸水紙。
6. 緩沖液必須以相近的速度，從周圍移向起始點。如果緩沖液需較長時間才浸潤到點樣點，或不均衡地經過點樣點，那樣品點不可避免地會形成條紋狀。
7. 步驟 30 中，如果還需要將肽從平板中提取出來以備進一步分析之用的話，不要使用烘箱進行干燥。
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其他
試劑：
熒光墨水或染料（可以從大部分工藝美術商店購得）
50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 7.3~7.6 （新鮮配制的緩沖液 pH 大致為 7.5），和 pH 8.0 （放過夜后 pH 會變為約 8.０，這對步驟 18 中的胰蛋白酶消化或胰凝乳蛋白酶消化比較理想）
2-巰基乙醇
20%（m/V）SDS
50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 7.3~7.6，含 0.1% （m/V） SDS 和 1.0%（V/V）2-巰基乙醇
2 mg/ml 載體蛋白（RNase A，BSA 或免疫球蛋白）溶于去離子水中（分成等份儲存于 -20℃ 或 -70℃）
100% （m/V） 三氯乙酸（TCA）
96% 冰冷乙醇
30% （m/V） 過氧化氫
98% （m/V） 甲酸
1 mg/ml TPCK-處理的胰蛋白酶（如 Worthington） 溶于去離子水或 0.1 mmol/L HCl （分成等份儲存于 -70℃ 或液氮中）
電泳緩沖液：pH 1.9、35、4.72、6.5 和 8.9
綠色標記染料
層析緩沖液
儀器：
單邊剃刀刀片或手術刀片
適用于契侖科夫計數法（Cerenkov counting）的閃爍計數器
1.7 ml 帶螺旋蓋的微量離心管（Sarstedt）
一次性的組織研磨件（Kontes）
搖床
具有吊桶式轉子的臺式離心機
20 cm × 20 cm ×100 μm 纖維素薄層色譜板（EM Sciences）
小體積可調移液器，由韌性塑料制成的一次性長吸頭，如凝膠上樣吸頭
帶濾器的空氣管，能濾掉氣溶膠和顆粒物質
HTLE 7000 電泳裝置（CBS Scientific）
聚乙烯膜 （35 cm × 25 cm； CBS Scientific）
電泳芯子（20 cm × 28 cm Whatman 3MM 濾紙，對折成雙層厚度的 20 cm × 14 cm的紙片）
層析缸（CBS Scientific）
風扇，用于吹干 TLC 平板
65℃ 烘箱
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