正常人包皮成纖維細胞的培養
正常人包皮成纖維細胞的培養
實驗材料：
1. 細胞來源：新生兒包皮；
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；
3. 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液：兩者比例為1：1，用D-Hanks液配制；
4. 0.02%大豆胰蛋白酶抑制劑：用DMEM培養液配制；
5. 生長基質：人纖維連接蛋白，按10μg/cm2包被培養皿；
6. DMEM培養液：DMEM培養基，加10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；
7. DMF培養液：為無血清化學限定性培養液。基礎培養基為1：1的DMEM和Ham F12混合培養基，加入EGF100ng/ml、胰島素100
ng/ml、轉帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗壞血酸10μg/ml、氫化可的松5×10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素。添加青霉素100
IU/ml、鏈霉素100μg/ml；
8. 無菌消毒手術器械、35mm培養皿、三角瓶、100目網篩；
9. 離心管（15ml、50ml）
實驗方法：
1. 分離表皮和真皮；
1） 在無菌條件下取新生兒包皮，用生理鹽水洗凈皮片上的血跡；
2） 將皮片放入盛有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；
3） 轉移皮片至培養皿中，小心分離表皮層并棄之；
4） 用DMEM清洗真皮片，備用；
2. 制備細胞懸液；
1） 充分剪碎真皮片，加入膠原酶溶液，于37℃孵育1h；
2） 用吸管反復吹打組織塊，分散細胞；
3） 經100目篩網過濾消化液，收集濾過的細胞懸液；
4） 離心細胞懸液（800r/min，5min），棄上清液；
5） 用DMEM培養液將沉淀的細胞團制成細胞懸液；
6） 細胞計數，調整細胞密度；
3. 有血清培養：原代細胞和傳代后的1—3代細胞用10%胎牛血清的DMEM培養液維持培養；
1） 以5×10-5個/ml的密度將細胞接種于培養瓶中。于37℃、5%CO2培養箱內培養。每2—3d換液一次；
2） 原代培養至成纖維細胞匯合成單層后，按常規方法傳代；
4. 無血清培養：用DMF培養液支持已建立細胞系的包皮成纖維細胞的生長和增長；
1）取在含血清條件下已生長匯合成片的培養物，棄培養液。用清洗3次，盡量除去殘留血清；
2）用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化分散細胞。在鏡下觀察到細胞變圓后，加入大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化；
3）加入DMF培養液，用吸管吹打分散細胞。調整細胞密度；
4）取已包被人纖維連接蛋白的35mm培養皿，每皿接種5×104個細胞。于37℃、5%CO2的培養箱內培養。每2—3d換液一次；
5）細胞長滿基質表面后，按常規方法傳代。
