體積排阻與分子烙印聚合物結合的高選擇性生物樣品固相萃取技術

在分析復雜生物樣品(如血漿、血清及尿液)的過程中，常常設計一個樣品預處理步驟，用來除去大量基體組分并富集所要的被分析組分。目前，固相萃取(SPE)是處理此類樣品的首選，但SPE是一個冗長的過程，其成敗決定于對樣品合適的萃取材料。近來，一類被稱為分子烙印聚合物的新型SPE材料，由于其特殊的選擇性，在分離領域越來越引人注目。

The analysis of complex biological samples, such as serum, plasma, and urine, generally involves a sample preparation step designed to remove many of the matrix components and enrich the analyte(s) of interest. Currently, solid-phase extraction (SPE) is the method of choice for samples of this kind, but SPE can be a lengthy process and its success is determined by the availability of suitable extraction materials for the sample in question. Recently, a new kind of SPE material called molecular imprinted polymers has become increasingly attractive in the separation sciences because of their tailor-made selectivity.

      固相萃取(SPE)是一種目前占主導地位的樣品凈化技術，不同類型、不同規格的一次性SPE預裝柱管已商品化。通過恰當選擇固定相、清洗及洗脫溶劑的類型，可使不同種類的化合物從復雜基體中分離出來，從而簡化了后續的色譜分離和定性過程。由于傳統的SPE方法涉及多步操作，費時、費力，且選擇性差，易出差錯，因此，在選擇性／專一性的SPE吸附劑基礎上，發展新型、高效、自動化的樣品凈化技術是人們所感興趣的研究課題。

1分子烙印聚合物

　　被稱為分子烙印聚合物(MIPs)的新型SPE材料，由于其特有的高選擇性^[1]，在分離科學中越來越得到廣泛的關注。MIPs對于烙印的被測物能產生類似于抗體的親合力，因此，與抗體類似，可用于高選擇性的SPE中。分子烙印聚合物(MIPs)的起源可追溯到Pauling在試管內生產抗體的論文^[2]及Fischer的關于鎖與鑰匙的作用原理^[3]，并于1972年由Wulff等第一次所描述^[4]。分子烙印的一般原理如圖1所示。

　　分子烙印的形成包括下面3個步驟：1)在非極性和非質子溶劑中，根據在給定的被測物(模板，烙印)與有功能團可聚合的單體之間存在的(非)?共價鍵合作用，形成了專一性的復合物。在這個步驟中，通過功能單體在被測物周圍的組配預先構成鍵合位點。2)在有交聯劑和聚合引發劑存在的條件下，在剛性和多孔共聚物內生成單淋?模板復合物，完成原位聚合。3)萃取除去模板分子，在聚合物骨架網格內留下獨特的空腔。被烙印鍵合位點的局部化學屬性與待測物的分子大小、形狀及官能團是互補的，從而允許待測物分子專一性地與模板結合。

　　基于MIP萃取指定的目標被測物，采用非質子、低極性有機溶劑，特別是在聚合過程中使用的相應溶劑，可以得到最佳鍵合(分子識別)效果。在有機溶劑中，特定的氫鍵得到穩定，而非特異性的憎水作用將受到抑制。此外，MIP吸附劑與含有水溶性蛋白質的流體接觸，可能會導致不可逆鍵合或基體組分的沉淀。因此，在純水溶液中不能得到有效的分子識別，要成功地應用MIPs進行直接的、重復性的生物樣品萃取凈化是不可能的。

2 6-S流程(Six-SPE)

　　任意一種被側物差不多都有獨特性，因此作者在有效地利用MIPs的基礎上，分別對水溶液的和生物流體的高選擇性SPE建立了一個新的樣品處理策略，被稱之為“6-S流程”[Six-S ProcEdure(Size Selective Sample Separation and Solvent Swltch，SiX-SPE)]^[5]，可實現全自動(在線)聯柱SPE流程(按分子大小進行選擇性樣品分離及溶劑切換)。6-S流程包含兩個完全不同的步驟：第一步，采用特制的SPE吸附劑，對生物流體的大分子基體餾分和低分子質量組分按分子大小進行選擇性分級；第二步，通過切換系統，采用高選擇性的MIP吸附劑進行分子識別，分離待測組分。

　　采用填充體積排阻固定相(RAM)^[6]的小型HPLC柱(25 x 4mm i．d．)完成按分子大小的選擇性樣品分級。體積排阻填料為特殊的球狀多孔硅膠顆粒(見圖2)，其表面具有可分別與蛋白質和待測物作用的雙模式局部化學特性。

　　顆粒的外表面由親水性、電中性的雙硅醇基所覆蓋，外表面不吸附基體組分(如蛋白質)，而顆粒內孔表面由烷基鏈(如C18)所覆蓋，被測物很容易到達疏水性的內孔表面，在此被萃取和富集。對比之下，大分子樣品化合物因自身體積的阻礙作用(6 nm孔徑)，它是按其分子大小選擇的，并直接定量地排放到廢液中。因此，應用RAM吸附劑可以多次注入未經處理的復雜生物樣品(體液，血漿，血清，奶液，唾液，發酵肉湯，細胞培養液的上層清液，組織以及食品勻漿等)而不會影響到色譜分離效果。

　　采用純有機流動相(乙脂優先)沖洗RAM柱，通過切換閥將RAM萃取物直接轉移到相應的MIP吸附劑上。把被測物選擇性地鍵合到烙印過的聚合物上，分子識別不會受到蛋白質、核酸等大分子基體組分的干擾，也不會受到水溶液條件的限制。Six-SPE操作程序扼要示于圖3。

　　作為描述RAM。MIP組合的實例，作者通過柱切換設計在線分離模式，建立了一套全自動化的集成HPLC柱切換系統，并用于未經處理的人血漿中止痛藥Tramadol(Grunenthal GmbH，Stolberg，Germany)的分離分析。用LiChrospher^?ADS RP-18(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)作為RAM固定相進行分級，采用Tramadol?烙印的聚合物作為MIP吸附劑。Tramadol。烙印的聚合物由Johannes-Gutenberg大學(Mainz，Germany)的Sellergren和Lanza博士通過將甲基丙烯酸(功能單體)、乙二醇二異丁烯酸(交聯劑)、甲苯(致孔劑)、偶氮二異丁腈(引發劑)混合，在15℃的汞燈下照射24h而合成。此后，將塊狀聚合物碾碎，并將顆粒徹底清洗和篩分。得到的可用填料直徑為25?36Ltm，用MeOH／H20(50／50，vol／vol)調成勻漿后，把它填充到不銹鋼HPLC柱管內(25×4mm i．d．)。

　　全自動SiX-SPE-LC分析100 μL未經處理的人血漿中的Tramadol得到的色譜分離結果見圖4。用UV220nm檢測，記錄的色譜峰相當于lμg Tramadol直接進樣的結果。

　　在最佳UV吸收波長下進行檢測，通過比較采用兩種處理方法得到的色譜圖說明RAM與MIPs結合(即Six-SPE樣品處理體系)能有效地從復雜試樣中除去大分子(如蛋白)以及低分子質量的內源性基體組分。因而，定量測定試樣中被測物不受干擾物的影響，使分析方法的準確性和靈敏度得到改善。

3 結論

　　本文提出了一種采用兩種特殊填料(RAM-MIP)組合的生物樣品預處理策略(Six-SPE)，它具有以下特征： 1)高選擇性萃取和富集被測物；2)高效除去干擾的基體組分；3)重復性好，可直接進樣，并能在線凈化未經事先處理的生物流體；4)即時處理光敏性試樣；5)提高分析方法的精密度、準確度及靈敏度；6)易于實現全自動化；7)在線聯接其他分析系統(如HPLC)和／或適宜的檢測器(如UV，FD，MS)。

參考文獻:

1. Sellergren B. Noncovalent molecular imprinting: antibody-like molecular recognition in polymeric network materials.TrAC 1997; 16(6):310-20.
   
2. Pauling L. J Am Chem Soc 1940; 62:2643-57.
   
3. Fischer E. Chem Berichte 1894; 27(2):985.
   
4. Wulff G, Sarhan A. Use ofpolymers with enzyme analogues sRllctures for the resolution of enantiomers. Angew Chemie Int Ed Eng 1972; Il:341-4.
   
5. Fleischer CT, Boos KS. Analyte-specific on-line solid phase extraction. Gff Spezial Separation 2000; 20: 15-17.
   　　　　
6. Boos KS, Grimm CH. High-performance liquid chromatography integrated solid-phase extraction in bioanalysis using restricted access precolumn packings.TrAC 1999; 18(3):175-80.