基于模塊化的96孔模式發展起來的固相萃取SPE方法

本文針對固相萃取方法發展的進展情況作一綜述，該方法有助于高通量實驗室操作實現流水線型。該系統將SPE柱插入標準96fL基板以加速和簡單化SPE過程。同時利用該系統篩選吸附劑類型，有效地從血清中萃取出萘普生(naproxen)。數據清楚地指明了提供好清潔度和高回收率的條件。

An advance in solid-phase exffaction method development that helps streamline high-throughput laboratory operations is described. The system employs SPE carUidges that can be insened into a standard 96-well base plate to speed up and simplify the process. To demonsuate the use of this system, various sorbent types were screened for the effectiveness in thle exuaction of naproxen from human senlm. The data gathered in the investigation clearly identify the conditions that provide good cleanup and high recovery.

        每18個月計算能力和速度大約翻一番，這種現象如此有規律以至于成為眾所周知的“Moore規律”。它經常被引用為技術節奏指數增加的指標。雖然長期內持續增長的例子少見，但技術突然增長的例子比比皆是。現以一家大藥業公司為例：在1934年至1994年這60年內，科學家們在尋找新藥過程中合成并篩選了約250，000種化合物僅從1995年起的幾年內，他們就篩選了4500，000種化合物^[1]。這表明篩選速度以360多倍增長??比“Moore規律”大約快10倍。樣品處理節奏的增長速度是驚人的。為了滿足對更高通量的日益增長的要求，將過程所有方面(從樣品采集到數據分析)集約化至關緊要。分析學家手頭有強大的新儀器和技術，并且大多數情況下他們必須改進樣品制備步驟，以及有時需重新定義優化條件。本文旨在闡明高通量實驗室中固相萃取(SPE)方法發展，同時介紹一種將該關鍵過程集約化的工具。

1 96孔板模式的SPE

　　96孔板模式的SPE裝置自從1996年出現已經在高通量實驗室得到了廣泛的應用和認可。在很大程度上，這主要歸功于一個事實96孔模式(8x12孔，中心間距為9．0mm)已經用于生物技術和藥物實驗室的篩分、稀釋和傳遞，以及其他與SPE無關的高通量操作^[2]。在自動化裝置上，通過微型化將傳統笨重的SPE柱插人其中。自動化裝置生產商聲稱：液體處理工作站的產量以5倍的速度增長^[3]；96通道的吸移管管理器萃取能力己超過1000樣品／h^[4]。LC-MS在藥物實驗室里的盛行加速了該模式的應用。該項強大的技術使得樣品分析時間大大減少，這樣樣品的制備就走向一個更明顯的“瓶頸”。96種樣品的一次性平行處理是提高樣品制備產量的一個明顯、有效和易行的措施。

　　雖然96孔板SPE增加樣品量的能力不容置疑，但其并不是沒有缺點。其中最主要的是方法發展的問題。理想上，方法發展過程涉及篩分各種各樣的與萃取效率和選擇性有關的吸附劑、優化床層量以及決定使用的溶劑和溶液的最優組成和體積^[5]。實際上，SPE方法發展具有偶然性，因為不好的方法發展會部分地、暫時地被有選擇性和靈敏性的檢測器所掩蓋。以下的分析問題經常可追溯至不充分的SPE方法發展：不重復的回收率、不充分的離子化或分解、加合物形成、LC柱阻塞以及精密儀器接口阻塞。而在96孔模式下，能夠方便地檢查方法發展，這是因為適合短時間內處理大量樣品的模式對于少量樣品處理顯得很笨拙、繁瑣。

2 96孔SPE方法發展中問題的解決

　　兩個問題常困擾著96孔SPE方法發展第一個問題，在典型單板上篩分各種各樣吸附劑和床層物質是不可能的。在方法發展中進行操作這個十分初始的步驟僅需要許多萃取板中一個萃取板上的少部分孔，這將是十分昂貴、費時且無用，分析學家經常通過在標準SPE柱上而不是在96孔萃取板上發展方法，以便繞過該步驟這又會帶來在96孔SPE方法發展中經常遇到的第二個問題：將標準SPE柱上方法轉移到96孔板上并非區區小事，標準柱和孔板在填料和吸附劑床層大小上的差異會導致在方技行為上的重要差別，要想使96孔SPE方法接近有效的標準柱方法，必須經常進行耗時的重新優化步驟。此外，SPE吸附劑[dbsl]生產商沒有提供床層物質在50或100mg以下標準柱，但在96孔板中床層物質量低至10和25mg是很普通的。在方法發展中若使用標準柱，這將有可能評價一些有潛在用途的96孔吸附劑和床層物質。

　　VersaPlate 96孔SPE系統(Varian，Palo Alto，CA)克服了傳統的單片96孔SPE板的局限性，并且集約了方法發展過程以實現高通量。該系統SPE柱很容易插人96孔板(如圖1)。這有助于快速定制96fL板結構，最終簡化且加速了方法發展過程。Luer-針頭管使得VersaPlate管既可用于96孔模式，又可帶有標準SPE柱的真空多支管模式。得出的產品既可整合在一起，又可作為單一組分。

3 高通量方法發展：單板吸附劑篩選

　　為了表明集約化的96孔SPE方法發展系統的可行性， 我們通過萃取人血清中萘普生(naproxen)來篩選吸附劑。Quadra 320移液管控制器(Tomtec，Hamden，CT)提供了高效的移液能力。現評估8種不同的吸附劑，在一個單獨的96孔板上每一種都采用三種不同床層質量。圖2為VersaPlate柱和基板的組合。由于大多數非極性SPE方法的簡便性、通用性、快速和與生物基體的兼容性，所以篩選采用非極性機制。

　　一個極性的弱陰離子交換吸附劑氨丙基[aminopropyl(NH2)]，在篩分過程中也得到了評價。極性或離子交換能有非極性相互作用，且較其非極性對應物選擇性更大。因此，一般和較傳統的非極性吸附劑一起評價這些吸附劑^[6]，是基于其簡單性和通用性來選擇最初的SPE方法。用強的和弱的洗脫劑來篩選，能更好辨別不同吸附劑和床層質量間回收以及潔凈度的差異(如果回收率或萃取潔凈度達不到最佳，那么方法發展早期引入復雜的洗脫方案會導致費解的故障排除)。含有萘普生(naproxen)(200μg／L)的血清樣品(1mL)用濃磷酸(20μL)酸化，在如圖2所示的VersaPlate 96孔板依據表1的程序進行萃取。所有的添加和傳遞都是用VersaPlate多只管上的Quadra 320移液管操作的。操作單個VersaPlate的時間不到15min。萃取物和倍他米松(betamet-hasone)(30μL的20mg／L甲醇溶液)混合，在Inertsil (GL Sciences Shinjuku，Tokyo，Japan)5 ODS-3 HPLC柱(150mm x 4．6mm)上，采用0．1％磷酸／乙腈(60：40)為洗脫劑，流速為2mL／min，240nm紫外檢測。
 

4 結果與討論

　　所有萃取物的純凈度都可以接受(沒有干擾物和素普生(naproxen)或內標一起洗脫出)。圖3為樣品色譜圖圖4為單板吸附劑篩分的平均回收率。正如所料，一些吸附劑／床層物質的結合產生了更好的回收率。這些差異是由各種各樣的因素引起的，比如吸附劑對分析物的吸附容量、干擾結合的程度、分析物和吸附劑間的作用強度(與吸附容量相關)以及在典型吸附劑萃取條件下樣品基質的效應。在方法發展過程中，分析學家必須對低回收率或差的純凈度作出合理的估計，然后通過調整方法參數來克服這些通常，幾乎沒有可利用的數據指導分析學家。然而，上面所提到的單板吸附篩選能提供重要的線索。篩選能夠辨別出因容量對差的保留造成的回收率問題，提供給定的吸附劑／床層物質相結合的重復性的數據，并且提供與其它被評價的吸附劑和床層物質的純凈度信息。

　　以下的步驟將依賴于分析的目的。例如，從圖4的數據可以得到一個好純凈度、高回收率、最短時間的萃取方法。在這種情況下，用于普通篩選方法的60mg NEXUS萃取柱能提供所有萃取所需的內容，包括好純凈度、高回收率和好的重復性。然而，不同方法目標針對不同的方法發展。比如，若方法發展目標是使洗脫體積最小，同時保證高的回收率，那么單板吸附劑篩選結果就針對不同的方法發展途徑。在這種情況下，C2和C8吸附劑的回收率不如NEXUS的高，但是。觀察到的回收率沒有作為吸附劑質量的函數而顯著增加，表明吸附容量不是問題所在。相反，低于最佳的回收率看來是由差的保留或洗脫所導致。這些有最小洗脫體積的吸附劑最有前途。在這種情況下，額外的方法發展集中在改進保留(例如，通過調節樣品pH或稀釋)或者硅膠為基質的非極性的吸附劑的洗脫效率(比如通過酸化洗脫溶劑來克服次要的硅羥基作用)。最重要的一點是已經找到了進一步優化的合適方向，并且，初步的吸附劑篩選和優化在一個早晨可以完成。

5 系統優點

　　VersaPlate系統使得科研人員可用多年來一直是色譜方法發展的基礎的知識和技術，但要把這些技術和高速度結合成一個模式。這種方法的優點包括：

●方法發展的完全自動化提高了樣品和溶劑處理的精確度和準確度。
●平行的方法發展使得所有的樣品得到同樣和同時處理。
●過程在幾小時內而不是在幾天內完成，能夠更好地控制方法發展變量。
●方法發展和過程使用同樣的儀器和SPE裝置消除了過渡性的錯誤和重新優化。
●快速的方法發展過程，不需在關鍵步驟之間進行協調。隨著對分析學家在保證分析質量下提高速度要求的增強，像這種能減少方法發展時間的靈活VersaPlate系統將變得更加需要。

參考文獻:

1. Dagani R. Pittcon 2000. C&E News Apr 3,2000:37.
   
2. Wells DA. 96-Well plate products for solid phase extraction : LC-GC 1999; 17(7):600-10.
   
3. Packard Instrument Co. Appl note, LHA-013A. Meriden, CT 1998.
   
4. Tomtec promotional documents. Hamden, CT 1997.
   
5. Ingwersen SH. In: Simpson NJK, ed. Solid-phase exRaction: principles, techniques, and applications, New York, NY: Marcel Dekker 2000, chap 10.
   
6. Simpson N, Van Home KC, eds. Handbook of sorbent extraction technology Harbor City, CA: Varian Associates, 1993.