固相萃取與液相色譜以及液相色譜/質譜聯用方案的開發和確認

本文描述了評價和確認SPE方法的策略。通過為血清中藥物的固相萃取選擇和確認合適的吸著劑來說明這個方法。分析了填充床層的穿透體積，它是吸著劑容量的一個量度。本文闡述了小顆粒、高容量性能的吸著劑填裝的小的吸附床層具有最好的分析效率。

Strategies are described for evaluating and validating SPE methods.The selection and validation of a generic sorbent for SPE of drugs from plasma is used to illustrate the methodology. The procedure uses frontal analysis to determine the breakthrough volume of the packed bed,which is a measure of the sorbent capacity.This study indicates that small adsorbent beds composed of small particles with high capacity provide the best performance.

        固相萃取(SPE)吸引人的一個特點是適用性強。但在哪些方面不適用，并且是什么原因造成的?現提出與優化方法有關而與上述稍有不同的問題：能不能在時間不變的情況下利用比較小的床層來提高回收效率，并且能夠達到多小，采用不同的吸著劑結果如何，顆粒大小對結果有什么影響?綜上所述可以認為，SPE缺乏系統的優化方法和確定的萃取步驟。在許多固相萃取方法的建立中，一直把萃取效率看作是檢驗方法優劣的唯?參數，但僅僅測量回收效率還不足以指出實驗失敗的原因，例如穿透、在傳輸管道中和在玻璃器皿上的吸著、由于光線和酶化或氧化的原因而引起的分析物降解等。這些因素使得固相萃取方法建立的實驗過程繁雜冗長并且最后確定的條件可能不是最佳的實驗條件。

　　由此產生了兩種評價和確認固相萃取方法的策略一種是比較吸著劑的保留容量和洗脫效率，另一種是測定樣品的萃取回收效率、穿透百分比以及吸附百分比。但兩種方法中哪一種方法比較適合于優化和確認樣品的預處理步驟經常被忽略。目前需選擇和確認一種通用的適于從血漿中提取藥物實驗吸著劑以用于解釋說明的方法論。

1自動化固相萃取

　　選擇一個Prospkt(Spark Holland，Emmen，The Netherlands)自動化固相萃取樣品預處理裝置(如圖1)作為裝置的起始部分。這個部分提供了一個通用的自動平臺，包括可替換的固相萃取管，避免接觸光和氧氣(兩者都能引起許多分析物降解并使回收率降低)。

2評價吸著劑

　　商業上有用的吸著劑樣品可從不同廠家獲得并填充到10mm x 2mm的Prospekt SPE管中。HySphre^TM C18 8μm，HySphere Resin GP 8μm和HySphere Resin SH 20μm從Spark Holland獲得。PLRP-s(18μm)從Polymer Laboratories(Amherst MA)獲得。30μm的吸著劑Oasis^TM從Waters Chromatography(Miford，MA)得到。

2．1測定穿透體積

　　前沿分析法(FA)是一種測量填充床層穿透的方便方法。FA是通過泵的作用使稀釋的分析物溶液通過床層，然后測量檢測器的響應時間。抽吸溶液繞過SPE管，直接進入檢測器，如圖2所示的A狀態。這樣就提供了強的檢測信號，顯示的吸收率相應于100％穿透。接著將閥進行轉換，分析物溶液將通過SPE管(圖2的B狀態)。由于分析物保留在SPE管中，結果檢測器沒有信號。最后，SPE管被分析物飽和，分析物開始穿透，這個延遲被稱作穿透體積，它是吸著劑容量的一個量度。圖3給出了一個穿透曲線和定義穿透體積的例子。

　　表1列出了7種不同分析溶質對于5種不同吸著劑的穿透體積。Oasis、GP、SH 3種吸著劑對7種分析溶液中的6種具有高的保留容量，因此，它們是進行下一步研究的最佳候選吸著劑。

2．2測定洗脫效率

　　單獨測量穿透體積只是指出了整個圖的一部分內容，而忽略了測量曲線的形狀。

　　圖4比較了PCP通過5種吸著劑的填充床層的穿透曲線。穿透后的曲線銳度就是洗脫效率的量度：比較陡的曲線有較好的洗脫效率，好的洗脫效率說明具有小的洗脫體積，也就是較少的稀釋。較少的稀釋就具有好的靈敏度。顯而易見，HySphere Resin GP和Oasis比Hysphere Resin SH的洗脫效率好得多。這樣，候選的吸著劑數量成為兩種：HySphere Resin GP和Oasis。為了比較，也將HySphere C18用作下一步研究的吸著劑。

3 SPE方法的認證

3．1樣品回收率、穿透量和對系統取樣管路吸附量的測定

　　進行SPE方法的建立和認證時，首先應說明的一點是穿透不是一個問題。將另一個SPE管與第1個SPE管串連起來就可以進行研究，如圖5所示。樣品從自動進樣器中以正常模式傳送到兩個串聯管中(圖5a)。如果在第1個管中發生穿透，樣品將被捕集于到第2個管中。要是沒有穿透，在第2個管中將沒有任何分析樣品。樣品在兩個管中都沒有保留的組分進入廢液池，這是SPE的正常模式。用SDU中不含洗脫液的溶液沖洗管路和SPE管后，通過轉換閥1、2、3(圖5b)用HPLC來測量取樣管路和傳送管路中溶質的吸附量。然后，轉換閥1(圖5c)用HPLC來測量管1中的萃取率。下一步，轉換閥2將管1中穿透出的大量分析物從管2沖洗到LC中(圖5d)。進入管2中穿透出的所有分析物都將被沖洗到分析柱中進行LC分析。

　　用上面描述的方法進行深入的評價和確認應該選擇兩種吸著劑(HySphere Resin GP和Oasis)中的一種。最后根據所描述的確認方案，用兩種吸附劑對含有3種黃嘌呤(可可堿、茶堿以及咖啡因)的混合物進行檢驗。

　　圖6a顯示了黃膘吟在管1中的萃取率圖6b顯示了相應的穿透量(從管2中得到的樣品)。由于吸著劑中至少有一種的回收率是100％，因此對于分析物的吸附不需要進行柱管分析。圖6a顯示了在KySphere C18上既沒有可可堿的保留，也沒有茶堿的保留(管1中沒有出峰)，這可由從圖6b觀察到的從管2中沖洗出的大的峰所證實。圖6b顯示了在Oasis上可可堿有穿透。圖6b顯示了HySphere Resin GP的吸附非常強，管2中沒有樣品，因而曲線是一條平坦的基線，也就是說沒有樣品發生穿透；因此，HySphere Resin GP是分析黃嘌呤應該選擇的吸著劑，并且是最有前途的通用吸著劑。

3．2血清樣品的應用

　　將黃嘌呤添加到血清樣品中，把保存添加樣品的小瓶放置在Prospekt中，不改變圖6所用的任何條件運行SPE萃取方案，結果如圖7所示。整個方法的建立和SPE的確認過程只需用幾個小時。

4結果與討論

　　利用可計量的泵、可切換的閥和檢測器來研究SPE填充柱的容量和穿透是非常簡單的。一般來說，穿透曲線斜率越大，SPE的效果越好。根據本篇和其他研究報告所得出選擇吸著劑的經驗應該選用小床層、小顆粒和高容量的吸著劑。Prospekt SPE系統比一般的小，僅能夠容納10?50mg的吸著劑。雖然采用小的床層，但仍然能夠為分析物提供足夠大的容量。檢測分析物在吸著劑上的穿透方案非常容易自動化。

　　在SPE過程中優化床層體積是進行研究的一個變量。分析物的穿透是導致在SPE過程中回收率較低的首要因素。為了避免這一點，許多人利用比需要更厚或者容量更高的床層。厚的床層的流速較低；他們在沖洗過程中加大了稀釋量。因此為了補償稀釋，需要增加蒸發步驟。但蒸發對許多樣品不利，浪費時間并在處理大量含有輕微污染物的流動相時有解決不了的問題，因而污染物存在于大氣中對環境造成影響，例如乙睛。

　　建立特殊SPE方法時，Prospekt系統可配置成自動測量回收率、穿透量及吸著量的裝置。這是任何一個SPE方法的建立必須研究的部分。

5 總結
　　以上描述的方案服從于對穿透量的篩選，當開發一個SPE-LC方法時，對方案的簡單修改也會使開發者要測量回收率、穿透量和在系統內的吸著量。這個方案必須有利于方法建立者去驗證SPE-LC分析系統和SPE管。