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  • 改進和簡化的液相色譜/大氣壓化學電離化質譜方法分析多種食品中的未衍生化的游離氨基酸

    上一篇 / 下一篇  2008-06-17 11:19:40

    引言

      按照官能團或“R”基團分類,共有22種氨基酸。22種氨基酸中的8種是必需的,它們是組氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸,即意味著人類必須從飲食中攝取一定的量以保證功能正常。對于食品工業,由于營養標注的需要,氨基酸的測定非常重要。

      一些氨基酸的測定方法基于柱前或柱后衍生化技術,已被證實能夠獲得很好的結果,但是存在分析時間長或重復性差的缺點。其它用于氨基酸測定的多數方法都涉及氨基酸衍生化之后或之前的UV吸收或熒光官能團檢測的色譜分離。盡管這些方法比傳統的需要在茚三酮和OPA衍生化后定量的離子交換方法快一些,但仍非常耗時,需要20至75分鐘,并且重復性差,難以操作。

      當前的研究目的是:1) 研究用于不同食品中22種游離氨基酸測定的簡便、快速、準確和可重復的LC/APCIMS方法;2) 研究一種簡單且無需凈化的氨基酸水提取法;3) 用窄徑柱以較短的運行時間進行篩查和定性定量分析。



    實驗

      LC/MS實驗是用包括二元泵、自動進樣器、柱溫箱的Agilent 1100系列HPLC系統配上裝有大氣壓化學電離源(APCI)接口的Agilent 1100 MS檢測器進行的。

      以選擇離子(SIM)模式進行數據采集,接口參數為:干燥氣(N2,100 psig)流速4L/分鐘,霧化器壓力55 psig,干燥氣溫度320℃,汽化室溫度425℃,毛細管電壓3千伏,電暈電流8 μA,碰撞誘導解離壓力55伏,駐留時間27毫秒。監測到的22種未衍生化的氨基酸離子見表1。


      色譜分離在ZORBAX Bonus-RP窄徑(100 mm × 2.1 mm,3.5 μm)色譜柱上進行,以含有0.01 mM乙酸的0.2%甲酸水溶液為流動相在400℃進行等度洗脫,流速為0.2 mL/分鐘。

    樣品分離

      根據樣品基質,對樣品進行研磨(使用混合器,網眼大小2 mm)或混合(使用Ultra Turrax)。干燥樣品如嬰兒食品、早餐谷類食物和餅干被研細,軟樣品如西紅柿、液體樣品如果汁,使用Ultra Turrax混合器混合。每種勻漿樣品在樣品制備前測定pH值。勻漿后的樣品置高密度聚乙烯瓶中加蓋塑料旋蓋在-20℃保存。稱取研細或勻漿樣品(鮮重1 g)至10 mL具塞離心管中。用渦流混合器混合2分鐘,混合物在-5℃以5,000轉離心5分鐘。取上清液,定量轉移至樣品瓶中,如頂部有油層,則應避開油層。在進行LC/MS分析前將上清液用0.45-μm尼龍注射式濾過的過濾。

    結果與討論

    質譜碎片和色譜條件優化

      在兩種模式下碎片譜圖可重現,對單個質荷比碎片可進行定量。分別將55、70和100 V源內碰撞誘導電離用于所有氨基酸,發現優化條件是55 V和正極性。使用優化的MS參數,所有最大豐度的碎片均出現。在此正離子APCI條件下,SIM-MS分析顯示出眾的定性和定量條件,整個運行時間在7.5分鐘以內。

    專屬性

      質譜檢測方法具有對洗脫化合物給出結構信息的優點。此外,共洗脫的化合物能夠通過選擇監測不同的質荷比離子達到分離。在本次研究中,使用了一種簡便、快速而且經濟的樣品制備方法。通過使用0.2 mM乙酸溶液提取,溶解在水中的膠體(淀粉)在離心時同時沉淀。如果食品樣品含有脂肪,低溫離心能夠將其分離。圖1顯示同一次進樣中得到的青豌豆中22種氨基酸的特征質荷比離子MS信號。



    食品樣品

      本項研究中,分析了22種食品樣品的氨基酸含量。食品類別包括嬰兒食品、蔬菜、水果、果汁、堅果、葡萄酒、啤酒、牛奶、雞肉和蜂蜜。每種食品的氨基酸平均含量見表2。


      每種食品中氨基酸的含量有很大差異。氨基酸含量的差異可能源于配方組成的差異和/或處理條件的差異。同時蛋白質成分能夠增大食品中游離氨基酸組成的輕微差別。提取前測定了樣品的pH值,果汁、啤酒和葡萄酒的pH值為2-3;西紅柿的pH值約為4;豌豆的pH值約為6;牛奶的pH值約為7。眾所周知,氨基酸的測定在許多領域都是極為重要的,例如:
      1) 從氨基酸的含量比例確定蜂蜜的地域來源
      2) 對嬰兒第一個月的營養分析,如是否補充足夠數量和質量的氨基酸以滿足如此重要階段的需要
      3) 一些重要的游離氨基酸,如天門冬酰胺、谷氨酰胺、天門冬氨酸和谷氨酸,在許多產品中是丙烯酰胺的重要前體

    結論

      本次研究開發了一種用以測定食品中的22種游離氨基酸的簡便、可靠和快速的LC/MS方法。該方法可廣泛應用于多種食品。我們的目標是對陽性模式下表現出靈敏度的未衍生氨基酸進行單次運行LC/MPCI-MS分析,并且加以改進,通過使用較酸性LC/MS流動相達到了非常短的運行時間,僅需大約7.5分鐘。從樣品制備到接下來的色譜運行能在不到25分鐘內完成。以前的研究,使用傳統液相色譜柱、長時間的提取和凈化,以及隨后的衍生化分析5份樣品預計需要1天時間。而用這種新的簡化的快速方法,同樣時間可以完成一批20個樣品的分析。

     


    TAG: 1100安捷倫氨基酸

     

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