用高分離度快速液相色譜對三七進行快速、高效分析

前言

　　中藥（TCMs）具有悠久的用藥歷史，其療效在中國及韓國、日本等亞洲國家都得到公認。在西方國家，也越來越普遍地將中藥作為食品添加劑或營養補劑。被使用過的中藥已經有11,000多種。對中藥的研究和質量控制很大程度上依靠儀器分離和分析的性能。

　　本研究建立了一種分析三七的高分離度快速液相色譜(RRLC)方法。用安捷倫方法轉移器輕松地將常規HPLC分析方法轉為RRLC方法。用不同提取方法從三七植物的不同部位制備不同樣品。用優化的方法分離這些樣品，得到的色譜圖顯示了不同的色譜峰輪廓。本應用報告還報道了定量結果。質控部門使用本研究中建立的更快、更好的方法，將縮短分析時間，提高樣品通量。使用這些方法還能節省溶劑消耗，改善整個分析過程。

　　三七，中文名三七或田七，在中國是一種重要而昂貴的藥材。它已經有400多年的栽培歷史，85%以上的三七都產自中國云南省。三七的功效在于促進血液循環、去除血液瘀積包括凝血，治療腫脹、緩解疼痛。最近的藥理學研究顯示，三七具有抗癌和保肝作用，如，對心血管和腦血管系統有保護作用1。三七的皂甙種類與著名的人參和西洋參(花旗參)相似，因為它們都屬于同一種屬。三七主要用于中國南方的不同驗方。著名的中成藥云南白
藥和片仔癀中也含有三七。

　　中藥的復雜基質常常給質量控制和研究帶來挑戰。2005版中國藥典收載了藥材三七及其復方制劑，如三七傷藥片，其中含有三七皂甙R1，是這些制劑中必須分析的成分。三七皂甙的分析時間一般是60 多分鐘。隨著對中藥的研究越來越深入，科學家們認為只控制1 到2 個成分還不足以確定中藥的質量，必須開發分離更多組分的質量控制方法。像中藥這種復雜樣品的分離比合成藥物的分離需要更長的分析時間。當需要考慮樣品通量問題時，理想的解決方案就是在較短的分析時間內達到相似或更高的性能。使用RRLC有可能開發出分析時間更短、性能更好，又節省溶劑的方法。對于生產質量控制來說，使用RRLC意味著產品批次的檢定出廠可以比使用常規HPLC方法更快。

實驗

儀器
　　用于開發RRLC 方法的Agilent1200系列高分離度快速液相色譜系統包含以下組件：

　　Agilent 1200系列RRLC系統包括：
　　? Agilent 1200 系列SL型二元泵，帶真空脫氣機
　　? Agilent 1200系列SL型高性能自動進樣器
　　? Agilent 1200 系列SL型柱溫箱
　　? Agilent 1200 系列SL型二極管陣列檢測器，配置微量流通池(2 μL體積，3 mm光程)
　　? Agilent 化學工作站B.02.01SR1，用于數據采集和分析
　　? Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，4.6 x 50 mm, 1.8 μm粒徑

　　常規HPLC為標準配置Agilent 1100系列液相色譜，包含以下組件：
　　? Agilent 1100 系列二元泵，帶脫氣機
　　? Agilent 1100 系列自動進樣器
　　? Agilent 1100 系列柱溫箱
　　? Agilent 1100 系列二極管陣列檢測器
　　? Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，4.6 x 50 mm, 5 μm粒徑

樣品和樣品制備
　　? 三七皂甙R1、人參皂甙Rg1和人參皂甙Rb1標準品購自中國國家藥品與生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Re和人參皂甙Rc 標準品購自美國Sigma-Aldrich公司。
　　? 三七莖葉提取物(NCLE)由用戶實驗室提供。莖和葉用60%乙醇提取，溶劑蒸干后殘渣用正丁醇溶解，再將溶劑揮發掉，殘留黃色粉末用甲醇溶解，待進樣。
　　? 三七根提取物（NRE）由用戶實驗室提供。粗品用水提取，用大孔濾膜過濾，濾液揮發至干。殘留白色粉末狀物質用甲醇溶解，待進樣。
　　? 三七購自當地一家藥材商店（品牌為同仁堂）。粗品用水/甲醇(30/70, v/v)超聲萃取30 分鐘，用0.22微米濾膜過濾，用澄清的濾液進樣。
　　? 水、乙腈和甲醇均購自美國Fisher公司。

方法轉換
　　需要將使用填充5 μm填料色譜柱的常規HPLC方法轉換成使用填充1.8 μm填料色譜柱的RRLC方法。使用安捷倫方法轉換計算器( 可用光盤，Agilent 1200系列高分離度快速液相色譜系統，發行號5989-5130EN)，可使這一過程簡便、快速(圖1)。方法轉換計算器上列出了各種不同參數，可以根據具體需求對轉換后的方法進一步改進。如需了解如何將一個常規HPLC方法手動轉換成RRLC方法，請參閱安捷倫相關應用報告2,3,4。

結果與討論

色譜圖
　　藥理學研究結果顯示，三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的藥效。使用特殊的提取方法以達到獲得更多有效成分的目的。用常規HPLC方法和RRLC方法分析三七樣品得到不同的峰輪廓。圖2顯示了用常規HPLC方法分析三七莖和葉提取物(NCLE)得到的色譜圖。這種分析通常需要60多分鐘5。如實驗部分所述，用于分析三七樣品的RRLC方法是在常規HPLC方法的基礎上開發的。用常規HPLC方法和RRLC 方法分析了相同的NCLE樣品。色譜圖見圖2 和圖3。圖3 中的色譜峰比圖2 中的更窄。這意味著分離復雜樣品的峰容量增加了。RRLC分析的分離度或分離性能優于常規HPLC。同時，分析時間從60分鐘明顯縮短到20分鐘。另一個要考慮的因素是常規HPLC和RRLC柱的選擇性應保持一致。如果新的RRLC柱與常規HPLC柱相比具有完全不同的選擇性，方法轉換將失去意義。在本研究中，峰輪廓和洗脫順序都相同，所以不需要再對新色譜圖中的峰進行鑒定。而且，二極管陣列檢測器得到的UV光譜圖將有助于進一步對色譜峰進行確證。

　　圖4 顯示了用RRLC 方法2 分析NCLE樣品的色譜圖。流速提高到1.5 mL/min，又縮短了分析時間。同時，保持了與圖3 結果相同或相當的性能。對于更復雜的樣品，縮短分析時間意味著將損失峰容量。所以，用戶必須在峰容量和分析時間之間進行權衡。

　　如實驗部分所述，有三種不同來源的樣品。圖3顯示了用RRLC方法1對三七根提取物(NRE)樣品的分析。樣品為用不同的方法從三七根中提取。色譜峰輪廓顯示，NRE 和NCLE含有不同類型的皂甙和其它成分。

　　為了檢驗所建立的RRLC方法是否能用于其它三七樣品，我們從當地的一家中藥店中購買了三七。品牌為同仁堂，中藥店已將三七研成粉末。三七分析的色譜圖見圖6 和圖7。圖6 用RRLC方法1 獲得，圖7用RRLC方法3獲得。與需要60多分鐘的常規HPLC方法相比，圖7中色譜圖的分析時間只有4分鐘。

　　三七莖和葉的提取物比其它樣品更復雜，為了節省時間并保持分離度，用方法1 或2 分析。對于不太復雜的樣品，如同仁堂的三七提取物，可以在更短的時間里用更快的方法分析，如圖7所示。

定量結果
　　用RRLC方法2 分析實驗部分所列的標準品。使用不同濃度水平的標準品繪制校正曲線，并測定了三個樣品的濃度。表2顯示了定量結果。NCLE含有許多種皂甙，但不含Rc或Re。NRE含皂甙種類較少，但含有本研究所分析的5 種標準品。同仁堂三七提取物中沒有許多種類的皂甙，也不含Rc 或Re，R1、Rb1和Rg1的濃度比NCLE和NRE高。所有樣品中三七R1的濃度范圍為0.029 到0.89 μg/μL。本研究中建立的定量方法可以很容易地用于不同提取方法三七的質量控制。

結論

　　中藥是復雜的天然產物，用常規HPLC進行分析需要高性能的系統和很長的分析時間。本研究中建立的RRLC方法顯示了在保持復雜組分良好分離度的同時，如何縮短了分析時間。色譜圖顯示了不同三七提取樣品具有不同的峰輪廓。考慮到應用的需要，使用更快流速的RRLC可得到更快的分析方法。本研究中建立的定量方法可以很容易地開發為三七產品的質量控制方法。用RRLC方法在保持或獲得更高性能的同時，顯著縮短分析時間，從而提高樣品通量，節省經費。