用1.8 μm反相(RP)色譜柱進行快速氨基酸分析(AAA)

引言

　　氨基酸的檢測和定量分析一直是蛋白質和食品分析的重要部分，1951 年Moore 和Stein 研制出了第一臺氨基酸分析儀，將未衍生的氨基酸(AAs)用離子交換色譜分離后，用茚三酮進行柱后衍生，在可見區檢測[5]。1958 年由Beckman 開發并推出了全自動分析儀。它成為蛋白質分析的里程碑，并在1972 年諾貝爾化學獎核糖核酸酶的研究中發揮了重要作用。以前需要幾周完成的分析，用該方法不到1 天就可以完成。Beckman新一代的氨基酸分析儀已將分析時間縮短到大約110 分鐘，但用茚三酮靈敏度仍然有問題。

　　用鄰苯二甲醛(OPA)和巰基乙醇進行柱后衍生反應有一些可能，但卻只能檢測一級氨基酸（見圖1a）。1971 年首次報道了用OPA對氨基酸進行柱前衍生[6]。衍生物相當不穩定，但這一過程可以實現自動化。靈敏度得到了提高，特別是使用熒光檢測(FLD)時。OPA不發熒光，其衍生物有很強的熒光，但二級氨基酸仍不能檢測。另一種衍生化試劑氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC)和一級、二級氨基酸都能反應生成穩定的衍生物，但其本身卻具有很強的UV 吸收和熒光（見圖1b）[7]。衍生反應結束后還需要進行提取或與疏水性很強的胺進行反應，以除去過量的FMOC和反應副產物[8]。這種方法也可以作為自動化柱前衍生方[9]，但商品化時存在問題，與沒有使用反提取的系統相比，相對標準偏差(RSD)較高。

　　1986 年惠普/安捷倫將這兩種化學反應依次結合，不用反提取實現了蛋白質水解液氨基酸的全自動衍生、色譜分離、檢測和報告[1]。1988 年開發并銷售了商品化的分析儀，總分析時間只有36 分鐘，靈敏度達到飛摩爾水平。這對于生物技術公司和大學的研究人員來說，無疑是邁向正確方向的一步，因為他們的樣品非常有限，尤其是在藥物研發的早期階段。

　　為了使其在商業上可行，需要進行一些化學上的改進：將硫醇換成3-巰基丙酸(MPA)使OPA衍生物更穩定；所有一級氨基酸先與OPA反應，將一級氨基酸從下一步的反應中定量除去；然后加入FMOC，FMOC只與二級氨基酸反應。由于FMOC、FMOC衍生物和反應
副產物比任何OPA衍生物的疏水性都強，所以它們不會干擾任何一級氨基酸的檢測。因為只有幾種FMOC衍生物，所以可以使用簡單的兩段梯度將這些氨基酸與反應副產物和FMOC分離[1]。詳見圖1 和圖2。相應于各個色譜峰的化合物名稱見表1。

實驗部分

儀器

　　本文中的結果都是在Agilent 1200SL HPLC 系統上測定得到的，該系統包含以下組件：
　　G1312B，SL 型二元泵
　　G1379B，微量脫氣機
　　G1367C，高性能多孔板自動進樣器(WPS)，配置
　　54 x 2 mL（前面）和15 x 6 mL 樣品盤（后面）
　　G1316B，SL 型柱溫箱(TCC)，安裝低擴散組件
　　G1315C，SL 型二極管陣列檢測器(DAD)，配置半微量流通池
　　G1321A，熒光檢測器(FLD)

　　儀器上的所有管線內徑均為0.12 mm（0.005 英寸）。

　　雖然還沒有試驗過，但較舊的儀器，如1100 二元泵系統，以及1100 和1200 四元泵系統也可以在4.6 mm內徑柱上完成這些分析。建議沒有經過廣泛試驗不要在這些系統上使用3.0 mm 和2.1 mm 內徑的柱子，因為使用這些系統延遲體積較大；由于延遲體積效應可能使較早洗脫的峰出現異常。

儀器配置

　　泵參數：混合器和脈沖阻尼器用100 mm 長的管線(0.12 mm 內徑)旁路連接，程序設置通過旁路（進樣命令0.1 分鐘后；見下面的WPS 參數），壓縮性設置采用：A = 35，B = 80

　　流速：2.1 mm 內徑柱采用0.42 mL/min ； 3.0 mm 內徑為0.85 mL/min ； 4.6 mm 內徑為2.00 mL/min

　　

　　DAD：PW 0.01 分鐘；狹縫4 nM ；停止時間7 min（根據應用調整）；流通池體積= 5 μl，6 mm 光程（安捷倫部件號G1315-60025）
　　信號A：338，10 nm ；參比390，20 nm
　　信號B：262，16 nm ；參比324，8 nm
　　信號C：338，10 nm ；參比390，20 nm
　　信號D：230，16 nm ；參比360，100 nmM

　　信號時間表C)：0.00 分鐘338，10 nm ；參比390，20 nm ； 5.53 min 262，16 nm ；參比324，8 nm（根據需要調整； 3.0 mm 內徑柱大約5.45 分鐘時切
換，4.6 mm 內徑柱大約5.4 分鐘切換）

　　FLD：PW 0.01 分鐘；停止時間7 分鐘（根據需要調整），流通池易碎，千萬不要將這種檢測器串聯在其它檢測器之前Ex 230 nm；Em 450 nm；濾光片295 nm（默認濾光片）信號時間表：0.00 分鐘Ex 230 nm，Em 450 nm，PMT Gain 9（根據需要）5.53 分鐘Ex266 nm，Em 305 nm ； PMT Gain 9（根據需要，波長切換時間見DAD，約增加0.03 分鐘）

　　TCC：使用時安裝低擴散組件；柱子一側T = 40 °C，出口側30 °C。兩側都使用低擴散組件。

　　WPS：默認體積設置為0.5 μl，進樣器程序中均采用默認進樣速度200 μl/min
　　進樣器程序
　　1) 從硼酸鹽瓶（安捷倫部件號5061-3339）中吸取2.5μl
　　2) 從樣品瓶中吸取0.5 μl
　　3) 在清洗口5X混合3 μl
　　4) 等待0.2 分鐘
　　5) 從OPA瓶（安捷倫部件號5061-3335）中吸取0.5 μl
　　6) 在清洗口6X混合3.5 μl
　　7) 從FMOC瓶（安捷倫部件號5061-3337）中吸取0.4 μl
　　8) 在清洗口10X 混合3.9 μl
　　9) 從進樣稀釋液瓶中吸取32 μl
　　10) 在清洗口8X混合20 μl
　　11) 進樣
　　12) 等待0.10 分鐘
　　13) 不通過閥

用于繪制校正曲線的氨基酸混合液

　　為了建立校正表和校正曲線，將17 種氨基酸加上4 種擴展氨基酸組合在一起，配制成各種濃度氨基酸的混合物溶液，內標的量一定。內標(IS)（正纈氨酸和肌氨酸）是氨基酸輔助試劑盒（部件號5062-2478）的一部分。這個試劑盒里的其它氨基酸（谷氨酰胺[GLN]、天門冬酰胺[ASN]、色氨酸[TRP]和羥脯氨酸[HYP]）組成了擴展氨基酸(EAA)。參見表2 和表3，分別配制成相應的低和高靈敏度溶液。

　　氨基酸標準溶液（10 pMoles/μL 到1 nMoles/μL）：
　　將各1-mL 安瓿的標樣（部件號從5061-3330 到5061-3334）分成每份100-μL，置錐形內插管中，加蓋，4 °C冷藏保存。根據實驗需要，校正曲線可以用2 到5 種標準品制成。

　　擴展氨基酸(EAA)儲備液：
　　該溶液是用氨基酸輔助試劑盒（部件號5062-2478）中6 種氨基酸中的4 種配制的。最終濃度為含18 nMoles/μL 谷氨酰胺、天門冬酰胺、色氨酸和4 －羥基脯氨酸的25 mL 去離子水溶液，用做低靈敏度標準溶液（表2）。超聲振蕩使其溶解。4 °C 下保存。將5 mL，18 nMoles/μL 標樣用45 mL 去離子水稀釋，配成1.8 nMoles/μL 的溶液，用做高靈敏度標準溶液（表3）。

　　內標儲備液：該溶液是用氨基酸輔助試劑盒（部件號5062-2478）中6 種氨基酸中的2 種配制的。最終濃度為含10 nMoles/μL正纈氨酸和肌氨酸的25-mL 去離子水溶液，用做低靈敏度內標（表2）。超聲振蕩使其溶解，在冰箱中保存(4 °C)。將5 mL. 10 nMoles/μL標準溶液用45 mL 去離子水稀釋，配成1 nMoles/μL溶液，用做高靈敏度標準（表3）內標，4 °C 下保存。

HPLC 柱

　　ZORBAX快速分離高通量Eclipse Plus C18，
　　2.1 x 50 mm，1.8 μm，部件號959741-902
　　ZORBAX快速分離高通量Eclipse Plus C18，
　　3.0 x 50 mm，1.8 μm，部件號959941-302
　　ZORBAX快速分離高通量Eclipse Plus C18，
　　4.6 x 50 mm，1.8 μm，部件號959941-902

流動相和進樣稀釋液

　　流動相A：10 mM Na₂HPO₄: 10 mM Na₂B4O₇，pH 8.2:0.5 mM NaN₃（5.6 克無水Na₂HPO₄ +15.2 克Na₂B4O₇ ?10H₂O溶于4 L 水+ 32 mgNaN₃）。用6 mL 濃鹽酸將pH粗調至9 左右，然后進一步調至pH 8.2。使用強酸時需小心。用0.45 μm再生纖維素膜過濾（安捷倫部件號3150-0576）。在室溫下約1.5 周內穩定。

　　流動相B：乙腈：甲醇：水（45:45:10，體積比）。所有流動相溶劑必須為HPLC級。

　　進樣稀釋液：100 ml 流動相A + 1，500 μL 濃H₃PO₄置于100-mL 瓶中。4 °C 保存。用前分裝至6-mL 樣品瓶中。使用強酸時需小心。

　　氨基酸分析所用的所有消耗品名稱和部件號見訂購信息。

衍生化試劑

　　硼酸鹽緩沖液：安捷倫部件號5061-3339
　　0.4 N 水溶液，pH 10.2。4 °C 保存。必要時可分裝。

　　FMOC試劑：安捷倫部件號5061-3337
　　從1-mL FMOC 試劑中吸取每份200-μL，置錐形內插管中，立刻加蓋，冷藏(4 °C)；分裝后如保存在4 °C，最多7到10 天內可用；如在室溫下保存，1天內可用。

　　OPA試劑：安捷倫部件號5061-3335
　從1-mL OPA試劑中吸取每份200-μL，置錐形內插管中，立刻加蓋，冷藏(4 °C)；分裝后如保存在4 °C，最多7 到10 天內可用；如在室溫下保存，1 天內可用。

　　水：去離子水，HPLC級。

　　氨基酸分析所用的所有消耗品名稱和部件號見訂購信息。

樣品制備

　　本文所分析的各種瓶裝啤酒樣品從當地獲得。制備時只需簡單的超聲脫氣。由于碳酸飲料超聲時可能引起瞬間爆炸，操作時必須小心。建議將啤酒倒入比其體積大得多的廣口燒杯中，以便容納產生的大量泡沫。

結果與討論

分離條件的選擇

　　在本應用中，我們采用了新的方法，使氨基酸分析可以在范圍更廣泛的色譜柱上進行。我們報告的結果是在快速分離高通量Eclipse Plus C18 柱上得到的，這些4.6-、3.0-和2.1-mm 內徑柱的填料粒徑都是1.8-μm，柱長都是50-mm。每個方法的唯一區別是流速，從而可以保持相同的線速度、檢測器波長切換時間，這樣，二級氨基酸可以包含在同一個的色譜圖中。

　　我們也用快速分離高通量Eclipse Plus C8 柱和快速分離高通量Eclipse XDB-C18 柱與C8 柱上進行了分離，這些柱子都填充了1.8-μm填料，規格也相同（本文未給出數據）。所有柱子都得到了與快速分離高通量Eclipse Plus C18 柱非常相似的結果（本文未給出數據）。在不同尺寸快速分離高通量Eclipse Plus C18柱上得到的相應的分離結果見圖3和圖4，分別為DAD和FLD 檢測。可以看出，不管用哪種規格的色譜柱，所有色譜圖的保留時間只有微小的變化。這些變化是由三種不同尺寸柱子延遲時間的微小差異造成的。因為延遲體積是恒定的，所以流速越高延遲時間越短。

重復性和線性

　　在以前的這類分析中，二級氨基酸的重復性總是比一級氨基酸差[1-4]。本文報道的方法中，我們提高了二級氨基酸的重復性，使其與一級氨基酸相當。在ZORBAX Eclipse Plus-C18，2.1-mm 內徑柱上分析所得到的相關數據見表4 和表5（不帶內標），4.6-mm內徑柱見表6（帶內標）。表4 中的絕對峰面積重復性好，所有氨基酸的平均RSD低于2%，只有2 個在3%以上。請注意，表5 和表6 中顯示所有氨基酸的線性也非常好，所有氨基酸R2 都接近1.00，加內標的要更好一些。用Eclipse Plus-C18，3.0-mm 內徑柱不加內標的分析結果見圖5 和圖6。圖7 可見在EclipsePlus-C18，2.1 內徑柱上進行低濃度氨基酸分析（柱上5.0 pMoles）的色譜重復性。上下重疊的圖譜可以很容易地比較保留時間的重復性和色譜峰大小。這些是原始數據，沒有校正，也沒加內標。

擴展氨基酸(EAA)和內標(IS)

　　有幾種氨基酸在蛋白質酸水解過程中會被破壞（天門冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸），還有一種氨基酸除了結構蛋白（羥脯氨酸）外，在其它地方幾乎不存在。此外，許多分析人員愿意在樣品中使用內標，以改善準確度和重復性。為了得到最好的結果，需要謹慎選擇內標。通常在下列兩種樣品處理步驟中加入內標：

　　1. 在進行任何樣品處理之前加到樣品中（如，酸水解之前）。它將較正可能發生的所有改變，當然，內標應對水解穩定，并與樣品中的其它組分進行相同的衍生化反應。為了正確地使用這種方法，標準品也應該水解；但這通常會帶來更多的變數，因為各種氨基酸的穩定性不同。絲氨酸就是一個例子，它隨著水解時間的延長逐漸被破壞。因此使用內標非常有用。

　　2. 僅在分析前加入，將較正體積量取誤差和自動進樣器的偏差，同樣假設內標和樣品組分具有同樣的反應性。本應用中采用的是這種方法。

　　這里報道的OPA/FMOC分析中，可以使用兩種內標：一級氨基酸用正纈氨酸，二級氨基酸用肌氨酸。兩種方法都可以用這些氨基酸作為內標（未列出數據），但方法2 肯定是首選方法。上述4 種氨基酸(EAA)都包含在安捷倫氨基酸輔助試劑盒(P/N 5062-2478)的標準品內。這些氨基酸用本文介紹的氨基酸分析新方法都可以完全分離。在快速分離高通量Eclipse Plus C18，2.1，3.0，或4.6 x 50 mm，1.8-μm色譜柱上的分離見圖3 和圖4。這兩張圖都包含內標正纈氨酸和肌氨酸，FLD 色譜圖中的柱上濃度是100 pMole，DAD的柱上濃度是250 pMole，圖中均有顯示。添加EAA和內標的步驟已有報道[4]。這一步驟可用于繪制實際樣品定量分析的內標校正表。這一步驟在實驗部分已做介紹，并列于表2 和表3 中。

實際樣品

　　圖8 顯示了各種窖裝啤酒的比較結果。每種啤酒中均加入了500 pMoles/μL的內標，從而可以比較計算出的相對氨基酸含量。比較結果顯示，這些啤酒的相對氨基酸含量與人們感覺并不一致，人們認為“普通”美國啤酒的氨基酸含量比傳統德國啤酒要低。結果顯示，至少有一些德國和英國啤酒生產商現在釀造符合美國口味的啤酒銷往美國。有可能這種美國的微釀啤酒與為德國銷售釀造的啤酒更一致，因為它的釀造符合德國純度標準，因此，“傳統的”德國釀造更有代表性。結果列于表7。

　　酸水解和后續的氨基酸分析在蛋白質分析中普遍使用。在實驗室和目前生物技術和制藥公司都在執行的新的過程分析技術(PAT)中，也對細胞培養基進行監測。有關這些領域氨基酸分析的文章將隨后發表。

結論

　　本工作對氨基酸分析方法進行了各方面的改進。使用1.8-μm粒徑色譜柱可使分析周期縮短一半，從35分鐘左右縮短到13.5 分鐘左右。最早洗脫的天門冬氨酸和谷氨酸的峰形都得到了改善。提高了二級氨基酸，以及反應最慢的氨基酸，如賴氨酸的重復性。線性良好（r² 接近1），平均峰面積重復性低于2%。報道了各種內徑（ 從2.1 到4.6 mm） 的新快速分離高通量Eclipse Plus C18，1.8-μm柱的使用。新的流動相和進樣器條件非常簡單，只要簡單地改變流速就可以在2.1-到3.0-或4.6-mm 內徑柱之間進行轉換。也可以使用快速分離高通量Eclipse Plus C8 或快速分離高通量Eclipse XDB-C18 或-C8 柱（數據未顯示）。