不加三乙胺進行含氮化合物的色譜分離

引言

　　用反相HPLC 分離堿性化合物時，色譜峰的拖尾問題是大多數色譜工作者非常關注的問題。堿性和含氮化合物能形成能滿足分離和定量要求的對稱峰。由于許多生物活性化合物都含氮，因此給這些藥物和植化成份的HPLC分析帶來了困擾。

　　用反相HPLC分離堿性化合物時，色譜峰的拖尾問題是大多數色譜工作者非常關注的問題。堿性和含氮化合物能形成能滿足分離和定量要求的對稱峰。由于許多生物活性化合物都含氮，因此給這些藥物和植化成份的HPLC分析帶來了困擾。

　　有幾種克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的辦法。常用的措施是降低流動相的pH值，一般pH值小于3 時硅醇基將不再引起峰拖尾。在pH 值小于3 時，硅膠基質上的硅醇基被質子化（硅醇基的pKa 約為3.5），從而使硅醇基與溶質的相互作用減少。但是，這樣也可能改變了分離的選擇性和分離度，因此也不一定是好的選擇。

　　第二個措施是提高流動相的離子強度。通過增加流動相的緩沖容量，抑制堿性化合物與硅膠之間的相互作用。但是，當增加的緩沖液在儀器內外/在進行色譜分析時發生沉淀，特別是在泵密封墊上發生沉淀時，可能會帶來其它問題。應注意根據緩沖范圍使用適當的緩沖液。表1 列出了幾種最常用的緩沖液。

　　另一個可能的解決辦法是在流動相中添加三乙胺(TEA)。TEA作為一種競爭堿，減少了固定相硅醇基的可用性，也減少了分析物與硅醇基之間的相互作用。

　一些色譜工作者不贊成在流動相中加入競爭性胺，因為這使流動相添加了額外成分，將給色譜柱造成不可恢復的改變。要從色譜柱上洗掉較強的胺，如TEA，非常困難。這一現象的一個例子就是，系統中使用TEA后，正離子模式電噴霧LC/MS一直有m/z 為102的離子，說明污染的不只是柱子，還有管路[1]。要除去TEA，需要用5% 到10% 的醋酸清洗系統。也就是說，被TEA修飾過的柱子不再適用于那些流動相中不含TEA 的應用。TEA 的作用是競爭性堿，讓可能反應的硅醇基飽和，從而減少峰拖尾的可能性。對大多數分析來說，10 mM的TEA已經足夠，但許多情況下可能使用得更多。而且，TEA的堿性很強，如果添加到沒有緩沖或弱緩沖能力的流動相中，可能導致溶劑pH值急劇升高，可能會損壞色譜柱，進而影響分離，最終縮短柱壽命。最好的解決辦法是使用對TEA需求最少的色譜柱。

　　Eclipse Plus 采用了專利的硅膠處理技術，改進了鍵合和封端工藝，不用添加TEA，靠色譜柱本身就能降低峰拖尾。

實驗部分

　　所有分析都在Agilent 1200 上進行，系統包括一個自動進樣器、二極管陣列檢測器、二元泵、脫氣機、柱溫箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌侖西平樣品購自Sigma Aldrich（St. Louis，MO，美國）。將這些樣品溶解在50/50 MeCN 乙腈/水中。白毛茛樣品在當地購買，按照參考文獻2 中的步驟，用70/30/0.1% v/v/v 水/乙腈/磷酸提取，超聲、離心，用提取溶劑稀釋。黃藤素、黃連素和白毛莨堿標準購自Sigma Aldrich，用流動相配制。用這些標準品鑒定白毛茛提取物。

結果與討論

　　圖1 是Eclipse Plus C18 柱和另一種C18 柱上分離三種治潰瘍藥物：法莫替丁、甲氰脒胍和哌侖西平（添加TEA和不加TEA）的色譜圖。這三種含氨基藥物的結構見圖2。甲氰脒胍和法莫替丁是組胺H2-受體拮抗劑，通過關閉產生胃腸液的通路治療治潰瘍。哌侖西平是一種M1-競爭性毒蕈堿受體拮抗劑，能抑制胃酸的產生。治潰瘍藥是最常用的藥物。從圖1 中可以看出，加入10 mM 的TEA后，三種分析物在C18 柱上的峰形得到了改善。加入TEA后哌侖西平峰的拖尾因子從沒加TEA的1.74 變為1.02。但我們注意到，只要換成Eclipse Plus C18 柱，甲氰脒胍和哌侖西平的峰形和柱效都有了改善。實際上，這些峰的拖尾因子與使用了TEA的C18 非常接近，柱效更高。用Eclipse Plus C18 分析時，不需要任何流動相改性劑就能得到很好的峰形和柱效。

　圖3 顯示了Eclipse Plus C18 柱在分析功能食品白毛茛中的應用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、減充血劑，用于治療各種腸道紊亂，是使用最廣泛的功能食品原料之一。采用一種通用的方法[2]，評價Eclipse Plus C18和另一種C18柱，加TEA和不加TEA的分離效果。

　　在這個例子中，我們測定了500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的兩個主要成分是黃連素和白毛茛堿。方法中提到了黃藤素，但是在測定的植物Hydrastis Canadensis L（北美黃連）中沒有檢測到。這些氨基化合物的結構見圖4。

從色譜圖中可以看出兩點。第一，與另一個C18 柱相比，黃連素在Eclipse Plus C18 上的峰形有所改進。第二，隨著TEA的添加，C18 柱的選擇性有了明顯改善。最后要注意的一點是，在含TEA的色譜圖開始處有許多鬼峰或負峰。因為添加組分(14 mM TEA)加入到流動相中后，又加酸重新調節pH，簡單的流動相變復雜了，甚至變臟了。包括高質量的新鮮試劑的最好的實驗室操作，可以避免這一問題，但流動相污染的可能性仍然存在。更好的選擇是不加TEA。

結論

　　由氨基和硅醇基離子化產生的峰拖尾現象，通常可以通過降低流動相pH、增加緩沖液離子強度，或添加競爭堿，如TEA，得到緩解。這些措施雖然減少了峰拖尾，但也可能給方法開發帶來挑戰，如選擇性或分離度變差，降低柱壽命等。新的解決方案是用Eclipse Plus C18 固定相。它的硅醇基活性低，能為堿性化合物提供卓越峰形和柱效。