Eclipse Plus C18 柱和pH 選擇性在含氨基藥物分析中的作用

引言

　　在制藥行業中，經常用反相HPLC分析含氮化合物。生物堿衍生物、抗生素，以及許多生源物質都具有藥理活性。將一個新藥推向市場非常昂貴，但也非常有意義。制藥行業的競爭要求從藥物發現到最終產品的QA/QC的各個階段都提高效率。HPLC是藥物開發的每個階段中分離和鑒定潛在藥物、藥物降解產物、雜質、代謝物和其它相關化合物的關鍵工具。正確選擇HPLC柱直接關系著實驗室的效率，在很大程度上能縮短新藥上市的時間。

　　在本研究中，我們對三種含氨基藥物的市售劑型+2 個片劑和一個軟膏+ 進行了HPLC 分析，證明Eclipse Plus C18 柱是方法開發（如，在藥物開發的QA/QC階段）的首選色譜柱。改變流動相pH對改變感興趣峰與其它峰的選擇性和分離度非常有用，但pH也可能影響峰形。許多色譜柱在pH 3 以上都會有活性（離子化）硅醇基。正是這些硅醇基可能與分析
物發生相互作用。pH 決定著化合物，特別是含氨基類化合物的離子化程度，同時也決定著它們與HPLC柱上離子化的硅醇基之間相互作用的程度。許多色譜柱在中性pH下對弱堿和弱酸的分離都出現拖尾現象。但Eclipse Plus C18 柱卻能在pH 2.7 到7 范圍內對氨基化合物的分離呈現良好峰形。這一點使Eclipse　Plus C18 柱成為選擇性實驗和方法優化的首選柱。

實驗部分

　　三臺Agilent 1200 系列液相色譜儀均包括二元泵、自動進樣器、柱溫箱和帶半微量流通池的二極管陣列檢測器，除流動相外都設置了相同的方法：
　　系統1 A：0.1% 甲酸(v/v) pH 2.7
　　　　　B：乙腈含0.1% 甲酸0.1% (v/v)
　　系統2 A：20 mM醋酸鈉pH 4.8
　　　　　B：乙腈
　　系統3 A：20 mM磷酸鈉
　　　　　pH 7.0
　　　　　B：乙腈

　　這三個系統所用的梯度程序相同，10分鐘內以1 mL/min的流速從10 到100% B。在254 nm 和230 nm 進行UV檢測。分析柱采用的是ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 x 150 mm，5 μm，柱溫40℃。

　　本文所分析的含氨基藥物是鹽酸吡格列酮片(Actos，Takeda Pharmaceuticals)、雙嘧達莫片(Persantine，Boehringer Ingelheim Pharmaceticals)和利多卡因軟膏(E. Fougera & Co.)。將樣品制備成100 mg/mL活性成分的溶液。兩種片劑的樣品制備是將片劑用研缽研碎，轉移到試管中，加甲醇，超聲10 分鐘。提取溶液用0.45 mm PFTE 注射式過濾器濾至三個自動進樣器樣品瓶中，后進行LC 分析。利多卡因的制備過程與之相似，將稱量后的軟膏至于試管中，用甲醇超聲，過濾到自動進樣器樣品瓶中。化學結構和pKa值見表1。

結果與討論

　　含氮藥物經常被歸為弱酸或弱堿，因為它們在水溶液中發生部分離解。離子化的程度取決于水溶液的pH值和該化合物的pKa 值。Henderson-Hasselbach 方程描述了它們之間的關系：

　　pH = pKa + log [A-] / [HA]

　　在這里，pH是氫離子濃度的負對數，pKa是50% A-和50% HA 時的pH（通常稱為電離常數），[A-]和[HA]分別是共軛酸堿的濃度。

　　應當避免使流動相的的pH等于pKa，因為分子互換形式等量存在將導致峰展寬。當pH 值與pKa 相差一個單位時，分子的95%以一種形式存在，5%以另一種形式存在。當pH相差兩個單位時，該比例變成了99:1。最好在與pKa 相差兩個pH 單位的條件下進行分析。另外，氨基(NH+)與硅膠基質離解的硅醇基(SiO-)之間發生相互作用(在pH 3-7 之間)，這是第二種保留機制，以及對峰拖尾的影響因素。基于這些原因，使用低pH值流動相更好。

　　通常在低pH 條件下硅醇基的活性最小，堿性化合物的峰形最好。但有時也需要或首選中性pH 方法。在許多例子中，通過使用pH 緩沖能力良好的流動相，控制其pH 值，可以提高分析物與色譜柱之間的選擇性相互作用。

　　雙嘧達莫是治療心臟病的藥物，它能使血管舒張，抑制凝血。圖2 是用Eclipse Plus C18 柱在各種pH條件下進行雙嘧達莫劑的分析，包括與pKa相差1個pH單位的流動相。盡管雙嘧達莫在pH 7 和4.8 (pKa 6.4)時有兩種形式的平衡，但在接近和遠離pKa 的三個分離條件下，都得到了良好的峰形。

　　對藥物片劑的分析可能具有挑戰性，因為提取出的賦形劑、降解產物或未知成分可能對感興趣的峰造成干擾。

　　圖2 中所用的方法是梯度洗脫。用首選的低pH 流動相洗脫時，有一個未知峰（可能是降解產物）與雙嘧達莫峰共流出（上圖）。未知峰在中間和下面的圖中用箭頭標記。雖然在梯度方法中不常測定拖尾因子，在這里為了“看見”重疊峰進行了托尾因子的測定，如，低pH條件下拖尾因子較大。在pH 4.8 和7 的條件下，選擇性得到了改變，兩個峰得到了分離。在較高pH 條件下分離開的色譜峰有良好的拖尾因子，這也歸功于出色的色譜柱和合適的梯度洗脫方法。

圖3 是另一個藥物，吡格列酮，分析條件與圖1 中的相同。吡格列酮用于改善2 型糖尿病人的血糖控制。同樣，當在通常首選的低pH 條件下分離時，有一個未知峰與分析物共洗脫，見拖尾峰。將pH 調高，改變了選擇性，將吡格列酮峰與未知峰分離，結果得到了更對稱的峰。吡格列酮有兩個pKa：5.8 和6.4。在pH 7 條件下與pH 4.8 相比保留前移，表明該化合物在pH 6.4 條件下可能比pH 7 時的極性大。pH 4.8 的保留緣于2 個正電荷，而pH 7 時帶1 個正電荷。梯度改變了離子強度可能也起到了一定作用。

　　第三種藥物，利多卡因軟膏，是一種皮膚局麻藥。這是一種非結合型、單苯環藥物，所以在254 nm 下檢測信號不強（數據未顯示），但在218 nm 下吸收更強，利多卡因檢測靈敏度更高。圖4 顯示了用三種不同緩沖液分離利多卡因的色譜圖。醋酸色譜圖基線下移是因為醋酸在218 nm 下有一定吸收。隨著梯度的改變，有機相比例增加，醋酸鹽減少，UV 吸收逐漸降低。磷酸鹽流動相在218 nm 幾乎沒有吸收，所以其基線相對平坦。如在前面的例子中所述， pH 差異強烈地影響著化合物的選擇性和分離度，在整個pH 范圍，甚至接近利多卡因pKa 7.9 的pH，峰形都非常好。

結論

　　Eclipse Plus C18 柱使用了增強的ZORBAX基質硅膠，這種硅膠降低了硅醇基/分析物的活性，采用了先進的鍵合和封端技術，進一步減少了峰拖尾。因為這種固定相的硅醇基相互作用少，有助于通過改變pH 或陰離子添加劑來改變選擇性。在有機相梯度相同，pH緩沖液不同的條件下，解離的含氮藥物都能從Eclipse Plus C18 柱上洗脫下來。不同的流動相pH條件改變了色譜峰的選擇性，無論遠離還是接近分析物pKa 值，都保持了良好的峰形。