使用LC／MS／MS 測定食品中的黃曲霉素

引言

　　黃曲霉素（AFs）屬于真菌的次級代謝產物，是一類結構非常類似的化合物。這類霉菌毒素主要是由Aspergillus flavus 和A. parasiticus 產生的毒性非常強的代謝產物，人畜接觸后可能致癌[1]。根據流行病學證據，世界衛生組織和美國環境保護署將黃曲霉素劃分為人類肝臟致癌物。因此，為了避免接觸黃曲霉素使人致病，并且提高世界范圍的食品監督水平，有必要對其進行準確測定。對食品中黃曲霉素的常規檢測是通過薄層色譜法（TLC）和液相色譜法（LC），以熒光檢測（FD）結合柱前衍生化和柱后衍生化進行的。由于這類方法的高選擇性和靈敏度，LC/FD 技術得到了常規使用。此外，聯用技術在食品的殘留量分析方面得到了開發和應用，如LC 與質譜（MS）檢測器聯用技術。質譜檢測的高選擇性和
靈敏度與液相色譜法的分離能力相結合，對較大分子量范圍的物質在痕量水平進行定性和定量分析具有決定性的優勢。一些闡述不同類型的質譜方法用于黃曲霉素分析的論文已有發表[2-4]。

實驗部分

樣品預處理

　　待測樣品（花生、玉米、肉豆蔻和紅椒）來自當地市場并且不含任何黃曲霉素。按Tanaka[5]報道的經過驗證的方法進行了黃曲霉素的提取和清洗步驟。簡單地說，取樣品細粉20g，置200mL 錐形瓶中，對于玉米和谷類，加乙腈-水（9:1, v/v）40mL。振搖30分鐘后，取該混合溶液以1,650 g 離心5 分鐘。取上清液，用GF/B 級玻璃微纖維濾器（WhatmanInternation Ltd, Maidstone, 英國）濾過。取濾液5 mL，用MultiSep 228 號卡套柱進行樣品凈化。以1 mL/min 的流速過柱后，收集最初的2 mL 洗脫液。將洗脫液置40 ℃以溫和的氮氣流進行干燥。取殘渣，用含有10 mM 醋酸銨的甲醇-水（4:6 v/v）1 mL溶解。

標準溶液制備

　　取黃曲霉素G₂（AFG₂）、黃曲霉素G₁（AFG₁）、黃曲霉素B₂（AFB₂）和黃曲霉素B₁（AFB₁）等標準試劑，分別用乙腈溶解并制成1 mg/mL 的溶液，置暗處于4°C 保存備用。等量吸取上述各種貯備液至一樣品瓶中，以流動相稀釋并制成LC/MS 分析用工作標準溶液。每種黃曲霉素的最終濃度為1 ng/mL。

化學品

　　標準物質AFG₂、AFG₁、AFB₁ 和AFB₂ 來自SigmaAldrich Japan（東京，日本）。這些化合物的純度大于99%。醋酸銨、甲苯、HPLC 級乙腈和HPLC 級甲醇來自Wako Chemical（Osaka, Japan）。水為實驗室內部以Milli-Q 系統（Millipore, Tokyo, Japan）純化而得。MultiSep 228 號卡套柱購自Showa Denko（Kanagawa, Japan）。

LC/MS 儀器

　　本文中使用的LC/MS/MS 系統包括Agilent 1200 系列真空脫氣機、二元泵、多孔板自動進樣器、柱溫箱、帶有電噴霧離子源（ESI）的Agilent G6410 三重串聯四極桿質譜儀。方法研究的目的是為了獲得測定食品中黃曲霉素的快速而且靈敏度高的定量分析方法。
對不同的試劑和色譜柱進行了優化，以獲得最佳的色譜分離度和靈敏度，發現使用水、甲醇、醋酸銨的一種簡單溶劑系統和1.8-μm 粒徑的C18 柱有很好的效果。

LC/MS/MS 方法

　　使用MRM 方式進行定量分析。MRM 的參數見表1。

結果與討論

MRM 的優化

　　通過使用單級MS 全掃描模式及隨后的子離子掃描模式對1 μg/mL 的黃曲霉素標準混合液進行分析，實現了對每種黃曲霉素最佳MRM 的測定。這些標準混合液在全掃描模式和子離子掃描模式下的質譜見圖1和圖2。全掃描模式下，各種黃曲霉素的質譜均顯示質子化分子[M+H]⁺ 為基峰離子。選擇這些離子作為MRM 模式的母離子。各個化合物的最佳碰撞能量不同。為了確定最佳碰撞能量，將該參數從5 V 變化至40 V，間隔為5 V。如圖2 所示，觀察到30 V 時，各種黃曲霉素的子離子強度明顯最佳。各種強度最大的子離子分別為m/z 245（AFG₂），243（AFG₁），259（AFB₂）和241（AFB₁）。在上述結果的基礎上，碰撞能量設定為30 V。

　　表1 顯示每種黃曲霉素MRM 模式的參數。

　　各種0.1 ng/mL 黃曲霉素的MRM 色譜圖如圖3 所示。這些色譜圖顯示了所有黃曲霉素均具有出色的信噪比（S/N）。各種黃曲霉素的檢測限以該MRM 色譜圖信噪比的3 倍測得，如表2 所示。為評價校正曲線的線性，對從0.1 ng/mL 到100 ng/mL 不同濃度的黃曲霉素標準溶液進行了分析。如圖4 和表2 所示，所有黃曲霉素的線性均非常好，相關系數（r²）均大于0.999。

　　通過在谷類和玉米提取物中注入0.2 ng/mL 的霉菌毒素標準品，對本方法的基質效應進行了考察。谷類和玉米提取物的典型MRM 色譜圖分別如圖5 和圖6 所示。與霉菌毒素標準品混合溶液相比，未見兩種食品樣品基質帶來的其它色譜峰。這些結果顯示，MRM模式具有非常高的選擇性。

　　此外，與黃曲霉素標準品的色譜峰強度對比，考察了樣品基質中各種黃曲霉素峰強度的變化。結果如表3所示，各種成分的相對峰強度為88%-96%。因此，基質效應（如離子抑制）可能不顯著，并且可能使用外標代替與基質相匹配的標準品。

結論

　　本文中闡述的使用LC/MS/MS 測定多種黃曲霉素的方法適合于測定谷類和玉米提取物中的四種黃曲霉素，靈敏度高，選擇性強。該方法的另一優點是對于所有研究的食品樣品，未發現離子抑制。因此，無需與基質相匹配的標準品，這使得對不同來源樣品的分析方法更趨一致。