實驗試劑：

試劑貯備液：

1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸餾水配成100ml，pH8.9。

2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸餾水配成100ml，pH6.7。

3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸餾水配成100ml。

4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸餾水配成100ml。

5、 核黃素4mg，溶于100ml蒸餾水中。

6、 蔗糖40g，加蒸餾水配成100ml。

7、 電極緩沖液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸餾水配成1000ml，pH8.3，用時稀釋10倍。

8、 過硫酸銨0.14g，加蒸餾水配成100ml。

9、 溴酚藍1mg溶于100ml蒸餾水中。

10、 脫色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸餾水配成100ml。

11、 蛋白質染色液：考瑪斯藍G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸餾水80ml，溶解后混合之。

12、 過氧化物酶染色液：

1) 染色液甲：聯苯胺─抗壞血酸染色液，染色數分鐘。抗壞血酸70.4mg，聯苯胺溶液20ml（2g聯苯胺溶于18ml用文火加熱的冰醋酸中，再加蒸餾水72ml），0.6%過氧化氫20ml，蒸餾水60ml。

2) 染色液乙：聯茴香胺染色液，染色至少1小時。0.1mol/L醋酸緩沖液，pH5.5（0.82g醋酸鈉溶于80ml蒸餾水中，用醋酸調節至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸餾水中，用時新鮮配制。鄰聯茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸緩沖液(1)中。用時取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。

實驗步驟：

凝膠的制備：

1、 清洗干凈兩塊玻璃板，晾干后按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌膠支架上固定好。

3、 分離膠：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先將貯備液1，3和水放在一小燒杯中，過硫酸銨貯備液放在另一小燒杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽氣15分鐘，取出將過硫酸銨溶液并入，用玻棒輕輕攪動使之混合，立即注于干潔的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要進入氣泡。膠液注到離玻璃板口2cm處，立即在其表面覆蓋少量蒸餾水，靜置1小時左右，當見到水層下面有一清晰的界面時，則表明膠已聚合凝固，用吸水紙小心吸去上面水層。

4、 濃縮膠：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制備濃縮膠，連續平穩加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘。

電泳步驟：

1、 拔出樣梳后,在上槽內加入緩沖液,沒過鋸齒時可拆去底端的瓊脂糖。

2、 用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩態聚合。

3、 電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。

4、 凝膠板剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養皿內，加入染色液，染色1小時左右。

5、 脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到區帶清晰。

6、 實驗結果分析。

注意事項：

1、 固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。

2、 凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。

3、 水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。

4、 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。

5、 樣梳需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。

6、 要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果。

7、 注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉時會發生擴散。

8、 為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣.

9、 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。