Q：SDS－PAGE 電泳的基本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進 SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS 會與變性的多肽，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合 SDS 的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此 SDS 多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關，在達到飽和的狀態下，每克多肽可與 1.4 g 去污劑結合。當分子量在 15KD 到 200KD 之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 為分子量，X 為遷移率，k、b 均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。Q：配膠緩沖液系統對電泳的影響？

A：在 SDS－PAGE 不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是 Tris－HCL 緩沖系統，濃縮膠是 pH6.7，分離膠 pH8.9；而電泳緩沖液使用的 Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其 pH 環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而 CL 離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中 pH 的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH 對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？

A：根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS 處理、非還原 SDS 處理、帶有烷基化作用的還原 SDS 處理。

1、還原 SDS 處理：在上樣 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 Beta 巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成 SDS 與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣 Buffer，離心，沸水煮 5 min，再離心加樣。

2、帶有烷基化作用的還原 SDS 處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護 SH 基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的 DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul 樣品緩沖液中 10ul 20％ 的碘乙酸胺，并在室溫保溫 30 min。

3、非還原 SDS 處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用 1％SDS 沸水中煮 3 min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。Q：SDS-PAGE 電泳凝膠中各主要成分的作用？

A: 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關；制膠緩沖液：濃縮膠選擇 pH6.7，分離膠選擇 pH8.9，選擇 tris－HCL 系統，具體作用后面介紹；TEMED 與 AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高 SDS-PAGE 電泳分辨率的途徑？

A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致 SDS 結晶。一般凝膠可在室溫下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。Q：「微笑」（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。Q：「皺眉」（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

A：主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現拖尾現象？

A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現紋理現象？

A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是「鬼帶」，如何處理?

A：「鬼帶」就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在 WB 反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT 或 Beta 巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量 EDTA 來阻止還原劑的氧化。Q：為什么溴酚藍不能起到指示作用？

A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。處理辦法：更換正確 pH 值的 Buffer；降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？

A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的 pH 正確（6.7）；適當降低電壓；Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

A：這種現象一般初學者易出現。比如電壓 50v 以上，可電流卻在 5mA 以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a. 內外槽裝反；b. 外槽液過少；c. 電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？

A：這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。