一、實驗目的

了解等電聚焦的原理。通過蛋白質等電點的測定，掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直管式等電聚焦電泳技術。

二、實驗原理

等電聚焦（Isoelectric focusing，簡稱IEF）是六十年代中期出現的新技術。近年來等電聚焦技術有了新的進展，已迅速發展成為一門成熟的近代生化實驗技術。目前等電聚焦技術已可以分辨等電點（pI）只差0.001pH單位的生物分子。由于其分辨力高，重復性好，樣品容量大，操作簡便迅速，在生物化學、分子生物學及臨床醫學研究中得到廣泛的應用。

蛋白質分子是典型的兩性電解質分子。它在大于其等電點的pH環境中解離成帶負電荷的陰離子，向電場的正極泳動，在小于其等電點的pH環境中解離成帶正由荷的陽離子，向電場的負極泳動。這種泳動只有在等于其等電點的pH環境中，即蛋白質所帶的凈電荷為零時才能停止。

如果在一個有pH梯度的環境中，對各種不同等電點的蛋白質混合樣品進行電泳，則在電場作用下，不管這些蛋白質分子的原始分布如何，各種蛋白質分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度中相對應的位置處進行聚焦，經過一定時間的電泳以后，不同等電點的蛋白質分子便分別聚焦于不同的位置 。這種按等電點的大小，生物分子在pH梯度的某一相應位置上進行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”。

等電聚焦的特點就在于它利用了一種稱為兩性電解質載體的物質在電場中構成連續的pH梯度，使蛋白質或其他具有兩性電解質性質的樣品進行聚焦，從而達到分離、測定和鑒定的目的。

兩性電解質載體，實際上是許多異構和同系物的混合物，它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之間。常用的進口兩性電解質為瑞典Pharmacia-LKB公司生產的Ampholine 和Pharmalyte，價格昂貴。國產的有中國軍事醫學科學院放射醫學研究所和上海生化所生產的兩性電解質，價格便宜，質量尚佳。

兩性電解質在直流電場的作用下，能形成一個從正極到負極的pH值逐漸升高的平滑連續的pH梯度。若不同的pH值的兩性電解質的含量與pI值的分布越均勻，則pH梯度的線性就越好。對Ampholine兩性電解質的要求是緩沖能力強，有良好的導電性，分子量要小，不干擾被分析的樣品等。

在聚焦過程中和聚焦結束取消了外加電場后，如保持pH梯度的穩定是極為重要的。為了防止擴散，穩定pH梯度，就必須加入一種抗對流和擴散的支持介質，最常用的這種支持介質就是聚丙烯酰胺凝膠。當進行聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳時，凝膠柱內即產生pH梯度，當蛋白質樣品電泳到凝膠柱內某一部位，而此部位的pH值正好等于該蛋白質的等電點時，該蛋白質即聚焦形成一條區帶，只要測出此區帶所處部位的pH值，即為其等電點。

電泳時間越長，蛋白質聚焦的區帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率。這是等電聚焦的一大優點，不像一般的其他電泳，電泳時間過長則區帶擴散。所以等電聚焦電泳法不僅可以測定等電點，而且能將不同等電點的混合的生物大分子進行分離和鑒定。

早期的等電聚焦電泳是垂直管式的，其特點是體系是封閉的，不與空氣接觸，可防止樣品氧化。近年來，又發展了超薄層水平板式等電聚焦電泳。此法的優點是加樣數量多，節省兩性電解質，電泳后固定、染色、干燥都十分迅速簡便，其最大優點是防止了電極液的電滲作用而引起正負兩極pH梯度的漂變。

測定pH梯度的方法有四種：

1.將膠條切成小塊，用水浸泡后，用精密pH試紙或進口的細長pH復合電極測定pH值，然后作圖。

2.用表面pH微電極直接測定膠條各部分的pH值，然后作圖。

3.用一套已知不同的pI值的蛋白質作為標準，測定pH梯度的標準曲線。

4.將膠條于－70℃冰凍后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微電極測其pH。

三、儀器和用具

1.電泳儀

2.垂直管式園盤電泳槽一套

3.注射器與針頭

4.移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml

5.小燒杯若干

6.培養皿一套

7.直尺

8.小刀

9.精密pH試紙和帶細長復合pH電極的pH計

10.塑料薄膜和橡皮筋

四、試劑

1.丙烯酰胺

2.甲叉雙丙烯酰胺

3.兩性電解質

Ampholine（40%，pH3.5~9.5）

4.過硫酸胺（催化劑）

5.TEMED（四甲基乙二胺）（加速劑）

6.磷酸

7.NaOH

8.三氯乙酸（TCA）

五、溶液配制

1.丙烯酰胺貯液（30%丙烯酰胺，交聯度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，濾去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存數月。（全班公用）（另一配方為29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交聯度為3.0%）。

2.兩性電解質Amphline（40%）的加入量為：50ml /ml 膠液。

3.過硫酸胺：配成1mg/ml的濃度，當天配制，配100ml全班公用。膠液中的加入量為0.5mg/ml膠液。

4.TEMED：膠液中的加入量為1ml/ml膠液。

5.蛋白質樣品：選用兩種等電點相差較大的蛋白質，每根垂直管中每種蛋白質的加樣量控制在<100mg。蛋白質樣品配制成各為5mg/ml的濃度。配2.5ml全班公用。

6.固定液：10%的三氯乙酸，每組配50ml 。

7.陽極電極液：0.1M H3PO4

3.4ml 濃磷酸（85%）加H2O至500ml，每個電泳槽用500ml。

8.陰極電極液：0.5M NaOH 2g NaOH 加H2O溶解至500ml，每個電泳槽用500ml。