重組DNA技術工具酶

瓊脂 糖凝膠電泳是分子實驗的基礎技術，電泳遷移速率主要受到一些因素影響DNA的分子大小、DNA分子的構象、瓊脂糖濃度、嵌入染料的存在、電源電壓、離子強度影響。

實驗原理

一、DNA的限制性內切酶 酶切分析

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:I類和III類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。

III類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。

Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA 的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為 4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少數酶識別更長的序列或簡并序列。

Ⅱ類酶切割位點在識別序列中, 有的在對稱軸處切割, 產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位點在對稱軸一側, 產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。

二、凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無法分離的DNA片段。

當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外, 還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶, 用于以后的克隆操作。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質, 其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中, 在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移, 其遷移速率由下列多種因素決定:

1. DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2. 瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子, 其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb 的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%, 分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3. DNA分子的構象

當DNA分子處于不同構象時, 它在電場中移動距離不僅和分子量有關, 還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的, 超螺旋DNA移動最快, 而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時, 可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收, 用同一種限制性內切酶分別水解, 然后電泳, 如在凝膠上出現相同的DNA圖譜, 則為同一種DNA。

4. 電源電壓

在低電壓時, 線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長, 片段越大, 因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過 5v/cm。

5. 嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA, 染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。

6. 離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠), 電導率最小, DNA幾乎不移動, 在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液), 則電導很高并明顯產熱, 嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

試劑和器材

一、試劑：

l0×TBE緩沖溶液(0.89mol/L Tris–0.89 mol/L硼酸–0.025 mol/L EDTA緩沖溶液)：取

108g Tris，55g硼酸和9.3g EDTA(EDTANa2 · 2H20)溶于水，定容至1 000mL，調pH 8.3。作為電泳緩沖溶液時應稀釋10倍。

6×電泳加樣緩沖液：0.25% 溴粉藍，40%(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于4℃。

溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml, 用鋁箔或黑紙包裹容器, 儲于室溫即可。

二、 材料

λDNA: 購買或自行提取純化;

重組pUC19質粒;

EcoRI酶及其酶切緩沖液;

HindⅢ酶及其酶切緩沖液;

瓊脂糖(Agarose)。

二、 器材

電泳儀, 臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐, 瓊脂糖凝膠成像系統。

操作方法

一、 DNA酶切反應

1. 用微量移液槍向滅菌的eppendorf管分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μL, 再加入去離子水使總體積為19μL, 將管內溶液混勻后加入1μL酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻, 也可用微量離心機甩一下, 使溶液集中在管底。

2. 混勻反應體系后, 將eppendorf管置于適當的支持物上(如插在泡沫塑料板上), 37℃水浴保溫2-3小時, 使酶切反應完全。

3. 每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混勻, 以停止反應, 置于冰箱中保存備用。

二、DNA分子量標準的制備

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子, 其商品溶液濃度為0.5mg/mL, 酶解反應操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段, 長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個片段, 長度分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、 瓊脂糖凝膠的制備

1. 取10×TBE緩沖液20mL加水至200mL, 配制成1×TBE稀釋緩沖液, 待用。

2. 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖, 置于200ml錐形瓶中, 加入50mL 0.5×TBE稀釋緩沖液, 放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化, 取出搖勻, 此為0.8%瓊脂糖凝膠液。

3. 膠板的制備：將有機玻璃膠槽置于水平支持物上, 插上樣品梳子, 注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液其終濃度為0.5μg /mL(也可不把EB加入凝膠中, 而是電泳后再用0.5μg/mL的EB溶液浸泡染色)。

用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封有機玻璃膠槽兩端內側, 待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內, 使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低, 否則凝固不均勻, 速度也不可太快, 否則容易出現氣泡。

待膠完全凝固后撥出梳子, 注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。

4. 加樣：取10μL酶解液與2μL 6×加樣緩沖液混勻, 用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低, 則可依上述比例增加上樣量, 但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換槍頭, 以防止互相污染, 注意上樣時要小心操作, 避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

5. 電泳：加完樣后, 接通電源。控制電壓保持在60-80V, 電流在40mA以上。當溴酚藍條帶動到距凝膠前沿約2cm時, 停止電泳。

6. 染色： 未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mL的EB溶液中, 室溫下染色20-25分鐘。

7、 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的熒光條帶。

注意事項

(1) 酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。

(2) 酶活力通常用酶單位(U)表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1小時完全降解1μg λDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象λDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。

(3) 市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液(1×)進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。

(4) 觀察DNA離不開紫外透射儀, 可是紫外光對DNA分子有切割作用。 從膠上回收DNA時, 應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm), 以減少紫外光切割DNA。

(5) EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。

(6) 當EB太多, 膠染色過深, DNA帶看不清時, 可將膠放入蒸餾水沖泡, 30分鐘后再觀察。

本文總結了質粒DNA限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳的原理；DNA酶切反應和瓊脂糖凝膠的制備過瓊等瓊脂糖電泳操作步驟，需要注意的是EB是致癌物質，應避免自己免受EB的傷害。