• Western Blot技術專題

1981 年美國斯坦福大學的喬治·斯塔克(George Stark)發明了蛋白質印跡(western blot )。但是接下來二十多年的時間，Western blot 的步驟一直都沒有什么大的改變，大家還是沿用分子克隆上的技術和試劑。直到近幾年，一些新技術新產品的不斷涌現，使得Western blot 的實驗效率和結果的準確性都得了大大提高。現在Westernblot 中高靈敏度的化學發光檢測、準確定量蛋白、自動化操作和CCD 成像系統已經非常普及，目前的發展趨勢是多通道熒光檢測。廣大科研工作者一直以來可能關注試劑比較多，不過下面提到的這些新儀器新技術，讓Western blot 發生了革命性的變化。

傳統western blot 存在的問題

western blot 的原理非常簡單，但是過程繁雜漫長的讓人無法忍受，制膠1-2hr，電泳1-2hr、轉膜1hr-過夜、封閉1hr、一抗1hr，二抗0.5-1hr，暗房壓片顯色0.5-1hr，然后膠片掃描圖像分析。就算是熟手整個過程做完也要兩天時間。即使是這么辛苦，也未必能拿到想要的結果，那么問題到底在哪兒那?我們分步剖析一下傳統western blot的過程及其存在的問題：

1，制膠：凝膠聚合不完全，漏膠等問題都會影響電泳的分離，進而影響結果。

2，電泳：電泳過程中只能看到預染marker 的電泳情況，但是卻看不到樣品的真實情況。如果蛋白樣品降解，電泳行為異常，我都不會看到，等到結果出了問題以后，找原因又無從找起。,

3，轉膜：轉膜結束后無法看到樣品轉膜的真實情況，如果要觀察，則膠需要染色脫色。膜上檢測也能用只能麗春紅染色定性，大致看一下。無法計算每個樣品的轉膜效率是否一致。

4，暗房壓片：膠片檢測的線性范圍只有1.8OD，對與表達量差異大的樣品無法確切定量。壓片時間也需要優化，可能需要反復摸索，對與一些穩定性比較差的試劑，可能會出現條件還沒摸索好，光就淬滅了。

5，多蛋白檢測：如果想在一次實驗中完成對多種目標蛋白質的檢測，則需要復雜的剪膜(cutting the blot)、順序檢測(sequentially detecting)、stripping 和re-probing 等方法來操作，這些方法都會對結果的準確性產生影響。

由于存在這些問題，常常會發生科研人員辛辛苦苦做了兩天的實驗，卻拿不到想要的結果，但是又找不到問題出在哪里?導致一些科研人員對western blot 實驗深惡痛絕。

近些年來，隨著新技術和出現和新儀器的使用，傳統western blot 實驗所存在的問題也逐漸的得到了解決。

下面我們逐一介紹一下這些新的技術和儀器。

Stain Free 免染技術

Stain Free 免染技術源于2002 年發表在《Analytical Biochemistry》上的一篇文章。文中指出聚丙烯酰胺中的蛋白可以進行快速檢測。方法是將蛋白膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中，然后通過紫外光照射。在三氯化合物存在時，紫外光會驅使色氨酸發生反應，產物會發出可見區內的光，從而實現蛋白條帶在膠上的定位。Bio-Rad 公司利用了這項技術，并在其基礎上進行了二次研發，開發出了Stain Free 免染技術。

Stain Free 免染技術主要包括兩個部分：Stain Free 免染膠，和Chemi Doc MP 全能成像系統。當然，為了分析結果，你還需要電腦和Image Lab 軟件。Stain Free 免染膠與普通的預制膠可不同，含有專利的免染技術在里面，所以不能拿平時用的預制膠來代替。樣品制備及電泳步驟與普通的電泳一樣。電泳之后，取出凝膠，放置在Chemi DocMP 全能成像系統中。分離的蛋白通過特定波長的UV 照射而激活，產生熒光，從而被CCD 照相機捕獲。1-2 分鐘左右，蛋白的圖像就出來了，Image Lab 軟件還會根據蛋白Marker，自動估算每個蛋白條帶的分子量和數量，超級省心。

你看，完全用不著染料，也不需要等待，電泳完幾分鐘圖像就出來了。現在體會到科學技術是第一生產力了吧。

Stain Free免染技術的特點：

1,快速

這個自不必說，與一般的考馬斯藍染色相比，起碼省了兩個小時。對于一個熟練的科研人員來講，平常染色1小時，脫色半小時，還要洗啊、拍照、分析，至少也要2 個多小時吧。如果是一個生手，可能要折騰個一兩天，最后拿到的圖片可能還是慘目忍睹。現在好了，即使你是一個第一次跑膠的超級菜鳥，沒有任何的經驗，你也只需要最多5 分鐘就搞定了，連分析都替你包辦了，直接出來一張分析報告，包括凝膠圖像、分子量和純度分析。而且系統中用的是預制膠，最煩人的配膠、等膠的時間也省了，即開即用。在快畢業或急著發文章的時候，這一點尤其重要。

2,重復性好

有時候染色、脫色的時間不同，產生的膠圖也會相去甚遠。這里多一條帶，那里少一條帶，沒辦法進行比較。Criterion 就不同，分析標準化，數據之間容易進行比較。另外一點還是要歸功于預制膠。預制膠雖然貴點，可還是貴的有道理。畢竟是工業化生產的，跟我們手工配制的就是不一樣，而且有時候試劑放太久了，配出來的膠其實就是不合格的，結果當然不會漂亮。

3，操作極為簡便

Chemi Doc MP 成像系統加Image Lab 軟件，使用非常方便，無需手動調節焦距，光圈，曝光時間等參數。只需要你選擇樣品類型，放置好凝膠，成像系統就會自動的幫你拍到一張最優化的圖像。功能強大且操作極為簡單的中文軟件可以讓你輕松的在幾分鐘之內完成分子量計算、定量計算、純度分析等多種分析操作。分析結果可以直接用于文章發表，還可以直接輸出多種格式的雜志要求分辨率的圖像。

4,環保

整個過程中，你再也無需和有毒的試劑如丙烯酰胺、甲醇等打交道，也不會產生有機污染物，更加環保。環保最重要的就是保護自己，丙烯酰胺、甲醇等試劑雖然是劇毒的藥品，但是毒性的發作卻是慢性的，做完實驗不會馬上感覺到，但是日積月累將會對你的身體帶來巨大的傷害。

5，靈敏

靈敏度是大家最關心的問題。如果靈敏度不夠，再簡便省時也是白搭。事實證明，Stain Free 免染膠的靈敏度比考馬斯藍染料更高。而通過對一系列蛋白標準品進行LOD(檢測極限)和LOQ(定量極限)分析，Stain Free 免染膠表現更好，具體的分析步驟和結果請查看Bio-Rad 公司的技術札記(Bulletin_5782)。

從2 小時到2.5 分鐘，Stain Free 免染技術徹底顛覆了傳統的蛋白凝膠分析流程，讓我們更輕松地獲得更準確的結果。

快速可靠的電泳技術：

傳統的手灌膠不但耗費時間，而且質量難以把控，不同膠之間的重復性很差，預制膠的出現是這些難題迎刃而解。

由于Laemmli 系統能夠分離來源于不同緩沖液體系的眾多復雜樣品，其被公認為SDS-PAGE 技術的金標準。而傳統的Laemmli 系統的缺點在于凝膠基質的穩定性隨著時間推移而降低，所以手工制作的凝膠必須要隨用隨制。而商業化的Laemmli 系統的預制膠通常只有幾個月的保質期，而且隨著時間的推移凝膠的品質不斷地降低。

新的Mini-PROTEAN TGX (Tris-Glycine eXtended)預制膠PAGE 基于對Laemmli 系統的新型改良從而能夠顯著地增加凝膠基質的穩定性。TGX 凝膠用標準樣品和Tris/Glycine/SDS 電泳緩沖液并保留了類似Laemmli 的分離特性。

這種改良使凝膠擁有了超過12 個月的保質期并且結果的重現性極好。說到快，新的Mini-PROTEAN TGX (Tris-Glycine eXtended)預制膠的電泳速度快到讓人不可思議，一塊小膠15

分鐘就可以完成電泳過程。將原來的制膠和電泳過程由3 個小時以上縮短到15 分鐘，而且分離效果和重復性大大提高，應該算是一個革命性的技術了。

讓人不可思議的快速轉印技術做western blot 實驗的人都知道轉膜也是一個耗時的工作，根據目的蛋白樣品不同，轉膜時間從半小時到過夜不等。如果現在告訴你有一種轉膜方法，只需要3 分鐘，你是不是會驚嘆道“天哪，這是不是在開玩笑?之前配轉印buffer 都不止3 分鐘，現在竟然連轉印都完成了”我們不得不感慨科技進步之快，全能型蛋白轉印系統Trans-Blot Turbo ，就可以將轉印時間縮短至3 分鐘。

全能型蛋白轉印系統(Trans-Blot Turbo)是一款集速度、便利性和重復性于一體，能夠提供比其他現有方法更快的結果的改良版半干轉印系統。這個半干式系統采用了一種新配方的轉印緩沖液，并使用了一種特殊材質的濾紙。

這種組合能夠承受更大電流，使轉印不僅更快，而且更完全。整個轉印過程只需要7 分鐘即可完成，如果選用TGX預制膠，實驗時間更可縮短至3 分鐘。

Trans-Blot Turbo 包含兩個cassette，每個cassette 可容納1-2 塊mini 膠或1 塊midi 膠。這兩個cassette 是獨立控制的，你可以先轉一個，再去裝配另一個，非常方便。Trans-Blot Turbo 還有著靈活的設計。你可以選擇預設程序幫助指導實驗設計，并可根據實際需要人為修改程序并存儲調用。轉印過程可在無人照看下自動運行。同時，Trans-Blot Turbo 系統還可以兼容傳統的實驗耗材，真正實現了實驗方法的靈活性。

Trans-Blot Turbo 使用起來也相當便捷。即用型的轉印耗材包Turbo Pack 避免了準備緩沖液和膜的需要。轉印耗材包中帶有PVDF 膜或NC 膜，有mini 和midi 兩種規格。

高靈敏度的全能型成像技術

隨著技術的快速發展，成像系統成本越來越低，因而在現在的實驗室里使用冷CCD 成像系統來用于western blot實驗中的化學發光成像已是越來越普遍。目前幾乎所有Western blot 的新技術都是針對CCD 成像系統的，它代替了傳統的膠片成像。膠片成像雖然靈敏度很高，但也有很多缺點：耗時，需要暗房和顯影劑，膠片很貴，而且是一個消耗品，需要持續購買。另外，檢測線性范圍很低，用膠片上的蛋白條帶進行定量幾乎是“不可能的任務”，和目測一塊考馬斯藍染的膠沒什么區別。冷卻型CCD 照相機與X 膠片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度、高分辨率、動力學范圍廣等優點，而且還不需要膠片處理裝置及暗室。然而，這項技術要求底物能產生高強度長持續時間的信號，以被照相機捕獲到。不過這個也不是問題，Bio-Rad 公司開發了信號能持續24 小時的Western blot 試劑盒Western C kit，而且靈敏度超高，達到了飛克級別。

現在90%以上的研究者們Western blot 要檢測的都是兩個或以上的蛋白，因為除了目的蛋白之外還必須要有一個內參蛋白。多色的熒光Western blot 可以滿足研究者對于多蛋白分析的要求，使我們可以檢測到電泳中重疊的蛋白條帶，如果我們用傳統的化學發光方法，是無法將它們分開的。即使是對于分的很開的不同的條帶使用化學發光檢測也是很不方便，需要做復雜的剪膜(cutting the blot)、順序檢測(sequentially detecting)、stripping 和re-probing等方法，且結果也不能保證。

多色熒光檢測則可以省掉這些步驟，通過一次成像就可以完成多個蛋白的檢測，且相互之間沒有影響，有效的解決了這個問題。

說到成像，連續七年獲得生命科學產業成像分析系統大獎的Bio-Rad 公司在這方面當然是技高一籌。它的Chemi Doc MP 成像系統采用Peltier 冷卻的高分辨率數字CCD 技術，并結合了獨特的寬波長紫外激發光源及高效的光學設計，能提供目前最高的檢測靈敏度、均一性、靈活性及動態范圍，在性能表現上可與更昂貴的以激光為基礎的技術相媲美。

全能型成像系統ChemiDoc MP 是一臺集普通成像、化學發光成像、多通道熒光成像和Stain Free 免染技術于一體的全能型成像系統。其優越性主要表現在以下幾個方面：

超好的靈敏度

Chemi Doc XRS+ 作為目前化學發光成像系統領域的絕對領導者，其性能被大家一致認可。Chemi Doc MP 在其基礎上對核心部件進行了升級，使得Chemi Doc MP 的性能遠遠超過前者。由于采用了最高端的CCD，ChemiDoc MP提供了最好的化學發光檢測靈敏度，和最高的熒光檢測靈敏度。同時在檢測的線性動態范圍上要比film 高出很多(4O.D. vs 1.8 O.D.)，也節省了很多film 所必須的暗室、沖片機等設備。

杰出的圖像質量

ChemiDoc MP 系統在提供高靈敏度的同時自動產生可供發表的高質量圖像，最大分辨率可達1200dpi。即使將結果放大數十倍，客戶依然可放心的用于發表文章、講座演示、會議討論等。

無可匹敵的應用廣泛性

ChemiDoc MP 系統是一臺真正的全能型的成像系統，它可以適應客戶多種不同的應用要求。從多通道熒光檢測、化學發光檢測到普通凝膠成像，ChemiDoc MP 可以解決從凝膠檢測到膜檢測的多種不同應用。

希望在一個樣品中檢測不止一種目標蛋白質的客戶。使用ChemiDoc MP 的RGB、Chemi 和Stain-Free 檢測功能，客戶可以方便的在一次實驗中完成對多種目標蛋白質的檢測。而無需再去做復雜的剪膜(cutting the blot)、順序檢測(sequentially detecting)、stripping 和re-probing 等方法，且結果更加準確。

此外，作為一款全能成像系統，其預留的光源接口方便您將儀器升級到紅外成像等功能。

系統操作簡單快捷

Image Lab 4.0 軟件可以進行多通道熒光成像設置，用戶只需要選擇通路(channel)和應用(application)，軟件就會自動為您選定最合適的濾光片、激發光源和曝光設定，同時全程保持自動對焦。

軟件可在中英文版之間自由轉換，新手無需培訓就可輕松掌握。圖像處理及分析無需再用復雜的PS，Image Lab軟件將提供眾多的分析功能以滿足您的實驗需求，且操作極為簡單，其易用性超過美圖秀秀。

內置Stain-Free免染功能

作為Bio-Rad V3 Western Workflow 的一部分，ChemiDoc MP 內置的Stain-Free 免染技術，使客戶可以在Western實驗流程的不同階段都進行校驗，從而確保實驗結果的可靠性。

此外，ChemiDoc MP 還可以配合Stain-Free 免染技術方便的進行Total protein 的Loading control 檢測，使Western 的定量變化檢測更加準確，避免了使用單一看家蛋白(housekeeping protein)帶來的誤差，并且省時、省力、節省抗體。

總結

說到這里我們再回頭看一下傳統western blot 中的存在的問題是不都都已經被這些新技術，新儀器解決了。結果自然是不言而喻，新技術和新儀器的出現使得Western blot 變得更加快速、高效和準確。

這么多年來，Western blot 一直是我們研究蛋白的基本工具。借助于不斷涌現的新技術，Western blot 已經從定性發展到定量，從自然發光發展到化學發光到熒光，從一次只能檢測單個目標發展到一次可以檢測多個目標。期待更多杰出技術的出現，讓Western blot 更高、更快、更強!