DNA連接與轉化

快速細胞破碎法實驗步驟

1、挑取轉化平板上的單菌接種于含相應抗生素的2ml LB中,37℃振蕩培養至A590值為0.6～0.8.

2、取1ml菌液至1.5ml eppendorf 管中,9000rpm離心9min,去盡上清.

3、加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍1.67ml,加雙蒸水至200ml],混勻后,37℃水浴30min以上.

4、15000rpm離心15min.

5、吸取上清點樣電泳,觀察.

轉化子DNA的酶切鑒定

轉化子DNA的快速少量抽提

1) 菌液移至5ml Eppendorf 管中,9000rpm,離心9min,去上清.

2) 加溶液Ⅰ100μl,溶液Ⅱ200μl,溶液Ⅲ150μl,混勻,冰浴10min.

3) 15000rpm離心15min.

4) 吸取上清,加入異丙醇1ml混勻,置室溫15～30min.

5) 15000rpm離心15min,棄上清,加入75%乙醇洗滌2次.

6) 離心棄上清,真空抽干,加入適量1×TE溶解DNA.

7) 取少量DNA電泳,觀察濃度.