蛋白沉淀問題
嬰幼兒乳品中含有大量的蛋白,在實際檢測中,需要進行蛋白沉淀進行去除,蛋白沉淀過程對于回收率和凈化結果有很大影響,如果沉淀不完全,會造成回收率下降和干擾過高:造成色譜柱的污染、堵塞,嚴重降低色譜柱的使用壽命。
嬰幼兒食品有乳液狀態的,也有固態的。液態食品傳統的提取方法較為簡單,通常是使用乙腈或緩沖液進行蛋白沉淀,離心后取上清液進行進一步凈化。 傳統的乙腈凈化方法容易造成蛋白沉淀不完全。一些含脂肪較高的樣品在用乙腈進行蛋白沉淀時,乙腈易將樣品中的脂肪提取出來,造成提取液渾濁,回收率下降、干擾過高和色譜柱污染。
隨著樣品前處理技術的發展,蛋白質的去除引入了一些新的技術,如固相萃取方法、超濾膜技術。這些方法就可以很好的解決以上問題。
1 Cleanert? MAS方法
MAS(Multi-function Impurity Adsorption SPE),即“多重機制雜質吸附萃取凈化法”,該方法主要利用多官能化的復合吸附材料,以離子交換、反相、氫鍵等機理去除樣品中的干擾物質,同時將目標物質留在樣品溶液中,從而達到凈化和富集的目的。
MAS方法,對于無論中性、酸性或堿性的強極性化合物均具有較好的凈化效果。Cleanert? MAS產品中的MAS-WA,MAS-A和MAS-B,MAS-A適用于酸性物質:MAS-B適用于堿性物質。MAS-WA適用于中性及兩性物質。具體的選擇方法為:
根據樣品的極性選擇洗脫溶劑,乙腈、甲醇的混合溶劑具有良好的沉淀蛋白效果,乙腈與甲醇的比例一般為9:1-1:1。如果是強極性化合物,洗脫溶劑中可以添加適量的水,水的比例不應超過三分之一,不然會引起洗脫液渾濁的現象。如果是弱極性化合物,洗脫液可以添加適量的弱極性溶劑(如乙酸乙酯、二氯甲烷等)。
再根據樣品的酸堿性選擇產品和進一步優化洗脫溶劑。如果是中性、酸性或堿性化合物,洗脫溶劑可以選擇中性溶劑(如乙腈、甲醇混合溶劑)。如果是兩性化合物,溶劑應選擇堿性溶劑(如含1%NH3·H2O的沉淀溶劑)
MAS方法可以同時除去多種雜質而不吸附目標物質,具有較好的除磷脂、除蛋白效果,降低本底,提高方法的靈敏度。同時可與自動化萃取儀器兼容,便于高通量樣品處理。
MAS產品中特殊的疏水性篩板可以阻擋變性蛋白質,而乙腈等用于洗脫液的有機溶劑易于通過,從而使操作簡便易行。其操作步驟為:
柱管形式:
1. Cleanert?MAS管和試管放置于固相萃取裝置中:
2. 每管1-2 ml乙腈活化,負壓抽干:
3. 每管加入50-1000 μL樣品:
4. 每管快速加入適量的沉淀溶劑(乙腈與甲醇的混合溶劑效果更好),靜置3min,如果加入的樣品量較大,請用振蕩器振蕩幫助樣品與溶劑混合:
5. 加負壓,溶劑從管上流下,收集于試管中。
96孔板形式:
1. Cleanert? MAS板和96孔接收板放置于96孔板正壓或負壓裝置中:
2. 每孔1-2 ml乙腈活化,負壓抽干:
3. 每孔加入50-200μL樣品:
4. 每孔快速加入適量的沉淀溶劑(乙腈與甲醇的混合溶劑效果更好),靜置3min:
5. 加正壓或負壓,溶劑從板上流下,收集于96孔接收板中。
2 超濾膜技術
膜分離技術是用半透膜作為選擇障礙層、在膜的兩側存在一定量的能量差作為動力,允許某些組分透過而保留混合物中其他組分,各組分透過膜的遷移率不同,從而達到分離目的的技術。
超濾是一種能夠將溶液進行凈化、分離、濃縮的膜分離技術,超濾過程通常可以理解成與膜孔徑大小相關的篩分過程。以膜兩側的壓力差為驅動力,以超濾膜為過濾介質,在一定的壓力下,當水流過膜表面時,只允許水及比膜孔徑小的小分子物質通過,達到溶液的凈化、分離、濃縮的目的。對于超濾而言,膜的截留特性是以對標準有機物的截留分子量來表征,通常截留分子量范圍在1000~300000,故超濾膜能對大分子有機物(如蛋白質、細菌)、膠體、懸浮固體等進行分離,可以用于蛋白質的去除。