癌細胞液中蛋白質的二維液相色譜分離

摘要：所考察的二維液相分離／質譜方法是一種能對細胞中蛋白質信息形成二維質量圖譜的新方法。該方法用于監測蛋白質變化，諸如用二維凝膠電泳不易檢出的翻譯后修飾，具有分辨率高和質量精確的優點。該方法有助于推進蛋白組學的研究，特別是癌變過程的研究。并且提供了一個檢測生物標記物的詳細方法。

Abstract：A key goalinthe5eld of proteomics and cancer research is the ability to rapidly analyze and identify the measurable protein profile in cells, tissues, and even small organisms. Moreover, a methodology is needed that can quantitatively profile the protein composition of a cell and detect even minor modifications or alterations in protein structure at very low levels. The 2-D liquid separations/mass mapping method investigated in this study is a novel method for generating a comprehensive 2-D mass map of the protein content of a cell. The method has the advantages of high resolution and mass accuracy for monitoring changes in proteins, such as posttranslational modifications that are not readily detectable with 2-D gels. The method promises to facilitate progress in proteomic studies, especially in the progression of cancer, and may also provide a detailed method for the detection of biomarkers.

      蛋白組學和癌癥研究領域的一個關鍵目標是快速分析及識別細胞、肌體組織、甚至小生物體組織中可測蛋白質的全譜^[1，2]。另外，也需要一種方法能定量表征單個細胞中蛋白質組成并能在愈來愈低的檢測水平上測定蛋白質結構的微小變化或修飾。細胞中蛋白質結構的微小變化或修飾可能會導致其功能的改變。蛋白組學全譜的研究方法應該能決速識別目標蛋白質和它的修飾形態及其表達水平上的變化。此外，這種方法必須能提供許多蛋白質的信息，以便使細胞機理發生變化??涉及多種蛋白質的變化，依據形態或結構，它們能夠被同時監測。這種能檢測蛋白質結構變化的特征可以為研究癌癥發生的機理和診斷、細胞過程諸如細胞的老化、生長、對環境的損害或中毒性休克反應提供重要的方向。

    用于細胞中蛋白質表達圖譜研究的主要方法是二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-D PAGE)^[3，4]。該方技能分離1000多個蛋白質位點，蛋白質位點圖譜都具有每種細胞的特征。二維蛋白質點圖譜能夠提供一個參考，即圖譜的改變表示由于疾病或突變引起細胞或組織的非正常變異。此類二維圖譜可以用來定位某種癌癥導致的蛋白質改變^[l，2]。通過圖譜分析和視差方法觀察兩片二維凝膠上蛋白質位點的位置和強度差異，便可得到相關的信息。

　　雖然二維凝膠電泳是大規模蛋白質分離最有力的和目前最常用的方法，但是該方法仍然存在顯著的缺陷，如速度慢而且勞動強度大。標準形式的二維凝膠至少需要2整天才能完成一次二維凝膠分離和后續的蛋白質染色。另外，不同實驗室之間的二維凝膠重現性往往較差，即使在同一實驗室，不同批次凝膠之間的重現性也有限。缺乏重現性，就很難對不同凝膠上蛋白質位點之間的精確分子質量的溶解產物進行比較并加以解釋。問題在于二維凝膠電泳主要提供蛋白質的分離而不能識別，二維凝膠可提供等電點(pI)和部分分子質量信息。然而由二維凝膠得到的分子質量也許只有5％?10％的準確性，因此只有有限的識別價值。為了識別凝膠點、可以選擇質譜識別方法。可是離開其他各種處理凝膠中蛋白質的方法，用MS分析嵌入聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質是不容易的^[5，6]。雖然某些處理方法已經自動化，但仍然很慢，而且會造成蛋白質回收率的損失。所以迫切需要開發一種直接與MS相連的蛋白質分離方法。以精確的分子質量作為溶解產物間比較的新標準，這將會改善蛋白質分離的重現性。

　　二維凝膠方法在蛋白質分離及其后續分析方面的缺陷促使作者開發不同的蛋白質表征方法，這些方法包含蛋白質的二維液相分離和質量圖譜的應用^[7]。其結果是在等電點和分子質量基礎上可得到細胞中蛋白質含量的二維的、具有高分辯率的真實譜圖。二維液相分離包括液相中等電聚焦(1EF)的使用，接著用無孔硅膠反相高效液相色譜(NPS-RP-HPLC)作為第二維^[8]。從第二維流出的蛋白質可以直接在線使用ESI-MS或離線使用MALDI。MS檢測其固定分子質量。此方法具有幾個顯著的優點，包括速度和自動化。原則上，1000多個蛋白質能夠在數小時內被分離、質量檢測和收集，以供進一步分析。二維液相分離法可提供用于ESI-MS或者MALDI-MS分析的純蛋白質，從而得到高度精確的分子質量數據，其結果是一張優于二維凝膠的蛋白質圖譜，由此可以研究蛋白質的形態和詳細結構的改變，包括翻譯后的修飾。利用該法可分離大量蛋白質，并用酶和質譜方法作進一步分析。

1 實驗設計

　　本實驗使用二維液相分離，繼而用在線ESI-MS檢測獲取一張細胞蛋白質質量圖譜。實驗如示意圖1所示。分離的第一維使用液相中準備的IEF，根據等電點分離蛋白質。所用儀器為Rotofor(Bio-Rad，Hercules，CA)，蛋白質依據它們的等電點遷移到20個間隔內。IEF這一步耗時3?5h，收集每一組分，用于進一步分離。該方法允許高達數百毫克蛋白質的進樣量，同時可以使用相對多的表面活性劑促進所有蛋白質的溶解，因此即使是高度疏水性的膜蛋白，也可以應用該設備來分離。需注意的是，圖1中使用的是分析型的minirotofor(Bio-Rad)，總體積小得多。

　　分離的第二維是使用NPS-RP-HPLC來完成的，本工作的關鍵是應用無孔介質(Eichrom Technologies，Inc,，Darien，IL)分離大的完整的蛋白質。這類1.5μm、C18涂層無孔硅膠填料與傳統多孔子L柱相比，在分離蛋白質時具有重要優勢。使用無孔填料避免了蛋白質在多孔材料孔內的粘附，極大地提高了分辨率、分離速度以及蛋白質的回收率。從Rotofor收集起來的每個pI組分可能有50?100個蛋白質，能在大約10?15mhl內分離。實驗所用色譜柱為3．0 x 33mm并保持在65℃以增加分離效率和速度。這種短柱可以進行快速分離并且具有良好的分離度。實驗時，在流動相為乙腈／水、流速為0．4mL／min條件下進行梯度分離。實驗中進樣量是個問題，可用大型號柱子(8mm)或者串聯柱^[9]。將從NPS-RP-HPLC收集的蛋白質餾分進行酶解并用MALDI-MS進一步分析，或在線聯結ESI-MS測定完整分子的分子質量。

　　此類實驗的一個關鍵問題是蛋白質在液相中的溶解度。所用的溶解步驟將決定能觀察到的蛋白質數量和種類。正確的溶解方法是獲得細胞中所有蛋白質質量圖譜所必需的。作者實驗使用的樣品涉及多種癌細胞系，裂解過程包括-80℃冷凍。之后將細胞碎片懸浮于含1％正辛基-吡喃葡萄糖苷(OG)、6mol／L尿素、2mol／L硫脲、2％β。巰基乙醇、2．5％Biolyte(Bio-Rad)兩性電解質pH 4?10的溶液中，懸浮液在150 000 RCFG下離心1．5h，收集上清液準備作IEF分離。此時原始胞液的水溶性蛋白質主要在上清液中。此處的重點就是為了增加蛋白質的溶解度而使用了非離子性表面活性劑OGL^[10-12]，表面活性劑必須與儀器、NPS-RP-HPLC分離、MS分析相適應。尿素和硫脲降低非極性蛋白質與水之間的疏水作用，同時在HLPC緩沖溶液中加入0．1％的OG以增強分離時蛋白質的溶解度。

　　本實驗所用質譜儀為Micromass (Beverly，MA)，質量檢測器為LCT。該儀器是垂直加速飛行時間(TOF)質譜儀，帶有ESI離子化源以使從液相分離流出的大分子蛋白質離子化。該儀器分辨率為5000并具有高的質量精度，對大分子蛋白質而言其準確度可達100?150ppm。在分子質量為50 kD時，相差l0 D的蛋白質便可以分離，而分子質量檢測誤差為3?7D。高精度的特點對蛋白質識別和確定翻譯后修飾是必要的，高分辨率對辨別相似的蛋白質異構體十分重要。儀器的另一重要特征是TOF裝置的非掃描性，即通過實驗中反復循環和在線分離可以得到高的靈敏度。另外，ESI源是專為HPLC高流量設計的。在本文中，HPLC柱的流出物按1：1比例分為兩部分，其中到ESI離子化源的流速為0．2mL／min。

2 結果

　　圖2示出用ESI-TOF-MS在線檢測二維液相分離流出物的部分質量圖譜。結果是，對每個IEF組分而言，由NPS-RP-HPLC分離的蛋白質是由MS根據分子質量測定的。每個IEF組分的分離都結合到一個總二維質量圖譜中。圖2所示的質量圖譜是由選擇的人紅白血病(HEL)細胞溶解產物中的幾個pI組分構成的。然而，在最近的工作中已將同樣的質量圖譜分析方法用于卵巢及乳腺癌細胞系。該圖譜提供的信息與用pI和分子質量標記蛋白質的二維凝膠提供的信息相當所有的蛋白質都可根據pI和分子質量而被標出。圖2中每個條帶(band)代表一個蛋白質分子質量，而蛋白質的相對含量由彩虹色刻度圖象(rainbow scale image)表示。整個實驗在5?10h內可完成，而且原則上可以實現自動化。質量數據的實際組合仍然很耗時，軟件需要進一步開發。目前每個蛋白質峰的ESI質譜都被檢測為一系列多電荷峰(mutiply charged peaks)，可用MaxEnt軟件(Micromass)去卷積及優化以確定質量。

　　該方法的一個重要特征是使用LCT得到的高質量的分子質量數據，儀器對蛋白質所達到的分辨率是單獨使用二維液相分離不能達到的。MS法的分辨率比二維凝膠高很多。圖3示出了圖2中一個區域中的的質量譜，經放大，顯示出一個條帶包括兩個峰，這是二維液相單獨分離而不能分辨的。利用此方法作者已測定了許多與癌癥相關的蛋白質異構體。另外，結合高分辨和質量的高精度還能測定可能存在的翻譯后修飾(PTMs)，這對癌變是很重要的。

　　很多情況下，作者觀察到蛋白質分子質量增加80或160D，表明可能存在一個或多個磷酸化基團。利用此信息，其他可能存在的修飾可首先得到確定。然而，其他更廣泛的結構測定方法，如用MALDI-MS測定肽譜及用LC-MS-MS分析結構也都要求確定這些PTMs。更有意義的是，該方法可用來跟蹤與癌變有關的PTM形態的變化，因為這些PIMs往往與細胞中蛋白質信號機制有關^[12]。

　　與二維凝膠電泳相比，二維液相分離／質譜方法的一個重要優點是具有對蛋白質分子質量進行識別的能力。雖然可能由于蛋白質的修飾，其分子質量數據不能完全與數據庫中的數據相匹配，但是蛋白質質量譜技術能自動提供精確的分子質量和pI值以便識別。HPLC流出物可分流并可用餾分收集器將蛋白質溶液收集于微量收集管中，然后進行酶解并用MALDI-MS測定出肽質量指紋譜，用這種方法每天可收集、識別數百個蛋白質。另外，用MS-MS方法可作進一步詳細的分析。二維凝膠法不能直接與MS相連，因為蛋白質都嵌入聚丙烯酰胺凝膠中，使用液相分離法可以大大加速癌細胞溶解產物中蛋白質的分離和識別。為了適應臨床診斷和基礎研究，這些方法應大大降低目前的成本。

　　另一重要考慮是該法的廣泛性和定量問題。．二維液相分離／質譜方法能夠檢測的蛋白質分子質量范圍為5?85 kD，pI范圍為3?10，且在低分子質量及強堿性范圍內比二維凝膠有優勢，因為在堿性范圍內，電泳的結果常常較差。在典型的二維液相分離／質譜分析中，估計至少可以檢測和分辨750?1000個組分峰，在分子質量和pI范圍內可與標準模式的銀染法二維凝膠的分辨宰相媲美。此法仍有很大的改進空間，因為在軟件去卷積過程中丟掉了許多低響應的蛋白質分子。二維凝膠在超過100 kD的范圍內仍有優勢。也許，進一步的改進NPS柱技術能很快達到這個范圍。使用LCT檢測器能達到2?3個數量級的定量，相當于二維凝膠的染色法。定性分析對于檢測與癌變機理相關的蛋白表達變化和相關生物標記的研究十分重要。

3 結論

　　二維液相分離／質譜分析是一個新穎的方法，它能夠對細胞中蛋白質信息形成二維質量圖譜。根據分子質量和pI，該質量圖譜類似于二維凝膠電泳的圖譜。該方法具有高分辨率和高質量精度的優勢，適于監測二維凝膠電泳不能直接測到的諸如PTMs之類的蛋白質的變化。它也能提供高通量分離，識別細胞中的蛋白質，且能極大地降低蛋白質分析的成本，推動蛋白組尤其是癌變機理的研究，也能提供一個分析生物標記物的詳盡方法。

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