多重聯用：液相色譜和多重譜學方法的聯用

摘要：各種分析模式聯用使分析化學家威力大增。本文主題是幾種光譜儀與液相色譜儀的聯用，構成一個集成系統，在單次分離過程中就能提供一套綜合光譜信息。由這種多維技術創造了“多重聯用”(“hyphenation”)這個術語。

Abstract: Coupled orhogonal analytical modalities add greatly to the power of the analytical chemist. The subject of this article is the linking of several spectrometers with a liquid chromatograph into one integrated system that provides a comprehensive set of spectroscopic information from a single separation. For this type of multiple hyphenation, the term hypemation has been coined.

      早在1980年，Tomas Hirschfeld在一篇深思熟慮、有洞察力的文章中討論了分析中聯用方法的作用，并特別強調了氣相色譜和不同譜學方法的聯用^[1]。盡管這在當時只是一個新的設想，但術語”多重聯用”現在已被廣泛看作是色譜系統和一種起檢測作用并能提供譜學信息的設備的結合。本文的主題是討論由不同的譜學儀器組成一個一體化的體系在一次分離過程中提供全面譜學信息的問題。對于這樣一個多重聯用方法，采用了術語”多重聯用”以和單一譜學儀器的聯用方法相區別。那么這一課題的特色是什么呢?近20年左右，聯用技術如液相色譜-質譜(LC-MS)曾經是實驗室里最需要并被認為是一定會出現的技術裝備。的確，這個體系(指LC-MS)對藥物實驗室的改造是徹底的，以致在這些實驗室里往往難以找到一臺LC-UV(液相色譜-紫外光譜儀)或液相色譜-熒光光譜儀。LC-MS的廣泛應用對樣品中感興趣的成分的鑒定有顯著的影響，這些樣品過去都要事先純化后才能用譜學方法測定。

　　然而，且不論LC-MS的性能，它畢竟不能解決所有的問題。結構測定經常要用到核磁共振(NMR)譜。雖然LC-NMR裝置不像LC-MS那樣容易得到，那樣普遍，但是它在解決實際問題中已經得到廣泛應用。在藥物、天然產物、合成化學、環境等方面已經有大量文獻報道了LC-NMR的應用^[2]。LC-NMR和LC-MS盡管靈敏度有差別，但根據它們之間數據互補的本性，將它們聯合為統一的聯用體系是令人滿意的。這種聯用首次出現于1995年^[3]。緊接著其他課題組又報道了在一系列樣品中的應用^[4]。能成功地將NMR、MS聯接成一個統一的儀器裝置，就不難添加UV-VIS(紫外-可見光譜)二極管陣列檢測(DAD)方法，以獲得紫外光譜方面的信息，由于通常把UV檢測器都用作LC-NMR流出物的監視器，因而稍微升級就可做到這一點。現在，只需將FTIR(傅里葉變換紅外光譜)儀組合到這個體系，該體系就將成為一個真正的傳統意義上能提供全面結構測定數據的裝置。

　　為了探索這個多重聯用體系的潛力，近年來針對單個組分用流動注射分析(FIA)^[5，6]和結合一種或多種分離方法用于簡單的混合物分離”^[7?12]進行了一系列研究。這些研究暴露了由這些譜學儀器聯用所產生的實際問題。有些問題是顯而易見的，如所需的溶劑系統，它應和所有的聯用的譜學儀器相兼容又能進行不同樣品的分離。另外，還有一些復雜的問題，如儀器的位置(特別是NMR波譜儀與眾不同的磁場)；把所有儀器連接起來的管路；不同儀器對溶劑流速的要求；為獲得譜圖所需的樣品量和對最后數據的收集(管理)和解釋等。雖難易程度不一，但都需妥善解決。

　　近代的NMR、FTIR、UV-DAD和MS等儀器已經使它們和液相色譜的多重聯用更加容易，即它們能與流動相和流速變化范圍相適應。即使如此，仍然要細心地設計分離系統，例如要去除不揮發的緩沖鹽類，以保證聯用中MS有好的實驗結果和NMR譜圖中不變緩沖液和溶劑信號的干擾。

　　實際上，由乙腈和重水(D₂O)組成的流動相是個好的起點，通常使用氘代溶劑并不是必要的，尤其當乙腈在溶劑中的含量低于50％時。然而在某些情況下使用氘代溶劑則是有利的，例如當乙腈是溶劑中主要成分時(參見下面給出的非極性高分子添加劑分析實例)很難抑制溶劑的干擾。在被分析物的信號接近乙腈的甲基共振譜線的情況下，使用氘代溶劑可抑制溶劑(指乙睛)的干擾信號。

　　一系列不同的多重聯用實驗裝置在作者的課題組組裝，組裝的指導原則一方面取決于課題組當時的現有儀器，另一方面也取決于要研究的樣品類型。在所有這些實驗裝置中，基本上都采用了沒有改裝的、現成的商品儀器。理想情況的所有譜圖都應來自流動條件下；在在線收集樣品如IR和停流模式下的NMR進行譜學測量可提高靈敏度和信息量。這樣做很費時間，但測量可完成得很精細。二維NMR實驗在流動條件下是不可能完成的。停流條件下流出峰被保留在NMR的流動樣品池里。另外，停流條件下還可得到較弱的樣品譜圖，在流動條件下因NMR相對低的靈敏度而得不到有意義的信號。因此聯用裝置的操作需要經常在樣品分離和檢測之間進行折中選擇。

　　圖1是作者最近組裝的多重聯用儀的布局^[12]，在這個體系里3個相對不靈敏的、非破壞性的譜儀IR、UV和NMR放在同一個分區，而MS所需的樣品量很少，而且是一個破壞性的檢測器，通過插在柱出口的分流器將其放在另一分區。由于MS的高的檢測靈敏度，流出物約95％分流至IR、UV和NMR等譜儀，剩下的5％流到MS。并行連接的另一個理由是，當MS放在NMR后面時，可防止NMR的過壓流動池的泄漏。MS平聯安排還有個優點：對特定的流出峰可用MS觸發NMR的停流實驗，因為在流出峰進入NMR流動池之前已由MS獲得該峰流出的信息。

　　就本文所述的一系列譜儀而言，聯用后，靈敏度通常較低，如IR或NMR儀等。對于這樣一個特定的體系，評估其靈敏度時必須指出，對特定的色譜峰，要獲得NMR譜圖所需的樣品量和許多因素有關，包括樣品的分子結構、在NMR流動池停留時間??這個時間當然和流速有關、停流模式的選擇以及流動池的體積等。同時還應了解體系中任何一個譜儀的檢出限(LODs)和獲得一個特征譜圖所需樣品量間的差別。在后者尚無一個確認的術語前，不妨提出譜學檢出限(LOSI，the limit of spectroscopic identification)，它對應于定量分析中檢測限(LOD，the limit of detection)和定量限(LOQ，the limit ofquantification)之間的差別。近期的有關研究詳述如下^[10-12]：一個500 MHz的NMR波譜儀，作為在線流動譜儀，裝有60μL的流動池，流速為0．5?1．0mL／min。對一個低分子質量的分析樣品而言，LOD大約是10?20μg，而LOSI則為40?100μg。顯然，如果采用停流技術，對于簡單的一維NMR譜圖則其所需的樣品量將有所下降。FTIR的靈敏度和NMR相當。

　　實際上，在組裝HPLC-N-譜儀體系時，有價值的第一步是和F隊而不LC組裝在?起。這樣有利于觀察不同譜學儀器聯用時產生的問題，諸如如何優化流動、選擇分流比、測定溶劑的兼容性以及不同譜學儀器對不同分析樣品的靈敏度等，而不受色譜分離復雜性的影響。一旦這些因素確定后，則可引入色譜系統，只要溶劑系統經過仔細選定，一般不會產生太大的附加問題。事實上FIA系統是很耐用的，在上述實驗基礎上，聯用的FIA無疑是很容易實現自動化的，并可在常規分析中鑒定測試前收集的化合物。FIA運行良好的理由之一是它不存在復雜色譜流動相所造成的困難，而這個困難有可能被重水或簡單的氘代有機溶劑作流動相加以克服。

　　雖然和FIA聯用是令人滿意的，但更振奮人心的應是聯用和分離的關系。在作者最新的體系里，在線流動的UV、IR、NMR和MS等譜儀已經用于藥物、高分子添加劑及一系列含滋甾體的植物抽提混合物的研究。在藥物和甾體混合物研究中一個令人注目的特點是采用過熱重水作流動相 (即高于100℃的重水)。事實上，當溫度升高時，水的行為更接近于一個非極性的溶劑，由此增加了它的洗脫強度。就聯用而言，這有許多好處，因為它提供了一個簡單的流動相，而且它很容易和聯用中所有譜儀相兼容，它的干擾信號也遠少于簡單的二元溶劑混合物。過熱水色譜法在恒定的流動相組成時，可以來用程序升溫法，以確定一個液相色譜所需分離的有效的梯度(指溫度梯度，即程升速率)一采用過熱重水流動相，在色譜峰上獲得的譜學信息的實例見圖2。分析樣品是20-羥基脫皮激素(結構列于圖2)，它存在于植物Silene frivalskyana^[10]的抽提粗品中。這個譜圖約需150μg源料。在所述條件下，100μg是NMR波譜儀和IR光譜儀測定的LOSI值。

　　然而，不論這個結果如何令人向往，過熱水是不適用于極性相對較強的物質，更不會適用于所有的化合物的。采用所述體系研究了一系列高分子添加劑^[12]，這些添加劑都是些相對非極性的化合物，流動相有高的乙腈含量(約80％)。為了獲得滿意的NMR結果，采用了氘代的溶劑。作為一個例子，BHT(2，6-二叔丁基4-甲基酚)的測定結果見圖3(列出結構式)。

　　上述實例表明，聯用方法在技術上是可行的，而且LC-UV-NMR-MS體系已經有商品儀器。和作者課題組組裝的原型體系相比，現在組裝LC-UV-IR-NMR-MS體系是更容易，而且性能也更好。如果采用當代技術水平的各種譜儀，結合微內徑液相色譜法，并仔細設計以壓縮色譜峰的擴張等，那么用亞微克級樣品量進行全譜學方法的測定將是不困難的。

　　這里的主要問題不是譜學方面的，而是如何控制各種譜學儀器(包括色譜儀)以及收集、詢問、解釋這個體系通過計算機得到的大量數據。要充分發揮聯用體系的潛力，解決好數據處理問題是必不可少的。

　　做某些事僅僅在技術上可行，那絕不意味著一定是個好主意。本文一開始就引述了Tomas Hirschfeld^[1]的論文，看來引述他冰R-UV-NMR-MS聯用可能性的意見是適當的，“用計算機以及必要的界面裝置把它們組裝成一個自動化的體系，顯然而且肯定是可行的……當然可行性并不是把做某些事放在首要位置進行的充分判據。很難設想，把這些儀器組裝成一個自動化體系的要求將在那里出現。”他接著說，”當人們談論操作人員以人-機對話引導模式編制數據，進行從頭開始的結構研究，如同一個定性識別的改良方法時，情況將完全不同。”這個觀點在今天如同他首次發表時同樣正確。過去20年發生的變化是我們最終組裝了Hirschfeld 1980年論文中設想的裝置，希望今后20年，分析科學群體能解決尚遺留的問題。

參考文獻:

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