高溫液相色譜（HT-LC ）在醫藥領域中的應用：挑戰和成就

摘要：在藥廠中，建立適合于評價藥物活性成分（APIs）和配方藥效/ 純度的分析方法是其分析部門的主要工作。為了識別潛在的雜質，藥物實驗室采用的分析方法通常是比較緩慢的。然而，對于許多分析如研發、藥物代謝、化學過程研究，這些方法都是太慢而不合實際。一種提高液相色譜分析速度的方法是提高溫度，本文討論了升高溫度的優勢，包括靈敏度改善，選擇性變化，以及采用溫度梯度同時分析極性和非極性分析物。高溫色譜具有許多優點，隨著儀器性能的改善，這些方法將具有很好的重現性且能用于論證分析。

Abstract：The development of appropriate potency/purity methods for the evaluation of active pharmaceutical ingredients and formulations is a major concern for the analytical departments in the pharmaceutical industry. Many of the traditional LC methods used in pharmaceutical laboratories are slow runs designed to identify any possible impurities. However, for many applications, such as support for colleagues in discovery,metabolite studies, and process research, these methods are too slow to be practical. One way to speed up an LC run is to increase the temperature, and this article discusses the benefits of elevated temperatures, including sensitivity improvements, selectivity changes and simultaneous analysis of polar and nonpolar analytics using temperature gradients. The conclusion is the HT-LC offers many advantages, and the advances in instrumentation allow these methods to be highly reproducible and capable of validation.

1 前言

        在藥廠中，發展適合于評價藥物活性成分（APIs）和配方藥效/ 純度的分析方法是其分析實驗室的主要工作。許多研究人員通常根據經驗來建立相對穩定的液相色譜方法，這些方法也可能用于未來的臨床藥物檢測。研究人員希望采用這些方法將一些藥物生產過程中可能產生的雜質及潛在的降解產物與藥物活性成分分開。大多數的降解產物和雜質通常具有和藥物活性成分相似的結構，分析方法對于選擇性的要求具有相當的挑戰性。方法發展過程中為了確保所有的峰都能得到分離，常需要采用具有更強保留能力的較長色譜柱和較緩的流動相梯度來分析可能的降解產物。實際上，人們更希望建立等度的藥物活性成分的液相色譜分離方法，以減少方法在移植過程所帶來的重現性問題。通常的方法是采用150 mm × 4.6 mm 的色譜柱（5μm 或3μm 的填料粒徑），在45 min 內完成分析任務。

        可靠的分析方法能夠滿足臨床藥物穩定性評價或質量評價的需求。然而，當需要將雜質分離以便進一步識別時，這些方法的分析時間對于研發（毒性材料的純度評價）、藥物代謝（代謝產物的評價）、化學過程研究（純度評價用于改進合成過程）、藥物研究（賦形劑的兼容及配方開發）甚至是對于一般的實驗室分析而言都太長，甚至不合實際。分析時間取決于樣品對分析系統的適應性，這也將給那些等待分析驗證方法提供數據的部門很難做出決定。因此，探索不增加成本，且能在不損失峰容量和分辨率的條件下提高分析通量的方法具有非常重要的意義。

        液相色譜分析中提高柱溫（>40 ℃）的優點已有諸多報道^[1,2]。隨著溫度的升高，流動相的粘度將會降低，從而可以采用更高的流量（甚至可以高達8 mL/min）以達到高通量的分析。同時，由于流動相粘度的降低， 更細粒徑的填料（<3 μm）以及更長的色譜柱甚至多根色譜柱的耦聯可以被采用，從而使得一些很難分開的關鍵色譜峰能夠得到基線分離。此外，由于分析物在高溫下快速通過色譜柱，分析物的擴散也會得到改善，區帶展寬變小，柱效增加。系統溫度的升高也會改變水的介電常數，使得水具有有機溶劑的特征。方法發展中有機溶劑使用的減少，使分析成本降低，為液相色譜提供了一種“綠色”的流動相。由于當前儀器條件的限制，有機溶劑梯度尚不能完全被溫度梯度所取代^[3-5]。

        盡管幾年前高溫液相色譜的優點就已經得到認可，然而直到最近，商品化的儀器才克服了一些技術上的問題。在樣品進入色譜柱前，對流動相進行預熱可以解決溫度不匹配的問題；而在進入檢測器前，對色譜柱洗脫下來的產物進行快速冷卻可以解決檢測問題，將具有蒸氣傳感器的自動開關閥嵌入到商品化的柱溫箱中可以解決有機溶劑過熱所帶來的安全問題。值得注意的是，溫度不匹配問題的解決可以將色譜柱的柱效提高50% 以上。最近色譜柱技術的進步也為溫度可達到200 ℃以上的方法提供了穩定的色譜柱選擇。這些色譜柱包括氧化鋯、多孔石墨碳、預保護的多配位基硅膠和二乙烯基苯基質的色譜柱^[2]。

2 在藥物實驗室的應用

2.1 用于純度評價的快速液相色譜方法

        以作者的經驗，對于一個評價純度的分析方法，平均需要45 min 的分析時間。在進行樣品分析之前，還需要進行其他實驗，包括溶劑空白的分析、樣品的適應性、定量限等；每個實驗通常也至少需要進行5 次以確保定量結果。就這個時間范圍而言，一組樣品的分析至少需要3.5 h 的分析時間。而對于評價一個樣品的純度所需要的時間將長達6.5 h。

        這個時間范圍只有少數的實驗可以接受，那些需要更快循環周期的研發部門在進行分析之前將可能采用其他的方法，包括采用一些沒有驗證的梯度方法或者不評價空白或系統適用性。采用這些替代方法有可能會出現一些問題，包括由于雜質和藥物活性成分的共洗脫而造成的潛在雜質的丟失，系統不能達到足夠的檢測限，潛在的雜質在死時間下被洗脫，潛在雜質的定量結果不重現，以及與空白有關的峰定量等。高溫液相色譜（HT-LC）能夠加快這些評價純度方法的論證而不損失分辨率與選擇性。

        圖1 給出的序列圖是一種顯影混合物中光敏感成分的色譜圖，這種方法被第十次國際標準化會議推薦作為光穩定研究的標準分析方法。采用Zorbax C18 柱（75 mm × 4.6 mm）（Agilent Technologies, New Castle, DE）進行分析。流動相為水和乙腈，添加劑為0.01%TFA，采用70/30（v/v）的流動相等度分離20 min，然后在10 min內梯度變化至20/80（v/v）。

        圖1a 給出的是30 ℃下的色譜分離圖。方法采用較常用的150 mm × 4.6 mm 色譜柱（5 μm填料）。當將色譜柱的柱長減少一半、粒徑也降至3.5 μm 時，可獲得相似的選擇性而分析時間縮短一半。峰A 和峰B（API）的分離度為9.7。峰C 是兩個部分重疊的組分。圖1b 是溫度升至60℃的結果。API （峰B）的保留時間縮短.5min，而API 和峰A 的分離度（9.3）沒有改變；峰C 中的兩個組分在這一條件下完全重疊。圖1c是90 ℃下的色譜分離圖。峰A和峰B的峰高和總柱效顯著增加。但這些峰的分離度為7.6。選擇性仍然沒有改變，所有的峰都在等度區域中被洗脫。圖1d 仍然是溫度為90 ℃下的色譜圖，但有機溶劑梯度從7 min 開始而不是如前所述的20 min。峰C 中兩個成分的分辨率和30 ℃下相同。色譜柱在所有溫度范圍內均具有很好的重現性和穩定性。所有的色譜峰都能在30 ℃條件下得到檢測，在90 ℃下也能得到檢測且選擇性相似，柱效也有所提高，同時色譜峰變窄（這一點很重要，因為在高溫下色譜峰被顯著地壓縮），峰容量提高，從而可以檢測出以前沒有被檢測出的色譜峰。

        表1 總結了在120 ℃下API 純度分析實驗所得到的數據和結果。在120 ℃下獲得的數據是有限的，因為這個溫度剛好是聚醚醚酮（PEEK）材料的耐受極限。整個方法的運行時間從50 min降至20 min。這樣，一個樣品的純度分析可以在2.5h 內完成，包括系統適應性評價。除了改變溫度和有機溶劑梯度，不改變其他色譜參數而加快分析速度非常有意義。采用更長的色譜柱可以增加樣品在柱上的保留時間，而采用更細的填料在高流量下能夠得到更高的柱效和更好的分辨率。

        在高溫液相色譜分析中分析物的穩定性是一個主要問題。然而，到目前為止，以作者的經驗，還沒有遇到此類問題。對于熱不穩定的化合物，采用高流量可以減少或消除穩定性的影響，因為這可以減少分析物在柱溫箱中的停留時間^[4,6]。

2.2 改善靈敏度用于低含量雜質的測定

        正如我們所討論的，升高溫度可以加快分析物在流動相和固定相之間的傳質速率，而傳質速率的增加將會明顯降低分析物的縱向擴散。因此，我們可以看到峰高明顯增加而峰寬減小。這也是我們在前面部分中討論的高通量純度分析方法的結果，如表1 所示。如果以表1中主峰峰高的自然對數對溫度作圖，可以得到一條直線（如圖2ab 所示）。圖2b 是一種藥物活性成分中的潛在雜質（鹵化烷烴）定量限的自然對數隨溫度變化的曲線，從圖2b中可看出，當峰高呈指數增加時，靈敏度也呈指數增加。從0.09 至1 ppm（濃度為200 ppm 目標分析物的0.05 或0.5%）作低含量組分的線性曲線，線性關系顯示，對于特定的分析物，隨著分析溫度從30℃升至90℃，定量限可降低至原定量限的十分之一。靈敏度的提高對于開發部門控制和監測低含量有毒的潛在雜質及降解產物非常有利。相比那些采用昂貴的檢測系統（如LC-MS/MS）進行此類分析的方法，配備常規紫外檢測器的高溫液相色譜更經濟合理。

2.4 利用選擇性的變化提高分離度

        范霍夫方程指出，對于某一特定的分析物，其保留時間取決于與分析物在流動相和固定相之間的傳質有關的熱力學因素（ΔH^o），這也意味著某一分析物或某一類分析物的保留時間隨溫度變化的程度很難預測（如圖3）。以75 mm× 4.6 mm 的Zorbax SB-C8 柱（3 μm）為分離柱，以0.5% 甲酸/ 乙腈（72/28，v/v）為流動相等
度分離這些藥物活性成分（和各種在合成過程中產生的雜質）。所有組分的保留時間隨著分析溫度的升高而減少。與峰B 相比,峰A 和峰C受溫度的影響更加明顯。因此，峰B 和峰C 的洗脫順序完全顛倒。這種選擇性改變的特征在混合組分的分離中非常有用，因為它只需升高溫度，而無需改變其他的色譜條件。高溫下柱效的提高將有利于得到預想的分辨率。例如，圖4a 是一種藥物活性成分中痕量組分的色譜分離圖，采用C18 柱為分離柱，以0.01%TFA 和乙腈為流動相在45 ℃下進行分離。質譜推斷峰A 的結構時，發現有兩個組分被同時洗脫。分離方法不變，將溫度從45 ℃升至70 ℃，兩種成分可得到基線分離（見圖4b ）。將餾分收集下來進一步采用質譜和峰面積百分比分析，證實了兩種組分的存在。

2.5 采用溫度梯度同時分析極性和非極性化合物

        進行快速的溫度梯度分析是近年來儀器的重要進展之一。采用現代的預熱器，流動相可以在25~200℃之間均一重現地以約20℃/min 的速度被加熱。柱后冷卻單元可以避免溫度改變引起的檢測器波動，通常是將洗脫產物的溫度調整到一個固定值（如35℃）。因為水的極性隨著溫度的升高而降低，采用溫度梯度替代有機溶劑梯度的
可能性已有報道，但前者比后者對分離的影響要弱，因此還不能被普遍采用，但是這一特性仍非常重要。據報道^[1,2]，有機溶劑（乙腈和甲醇等）含量變化1% 和柱溫變化3~5 ℃時的洗脫效果相同。這些報道提出可以采用等度（100% 的水溶液流動相）分離低分子質量的化合物，例如可可粉成分和鎮靜劑或者低聚物和肽^[2-5,7]。

        與等溫下的高溫分析相比，采用程序升溫對色譜柱的要求更為苛刻。即使在低于120℃的溫度下，氧化鋯基質的色譜柱在溫度梯度條件下固定相也會逐漸流失。不僅作者的實驗室觀察到了這個現象，其他的實驗室也有類似的報道^[8]。實際上，色譜柱的選擇是一個很大的障礙，特別是在醫藥分析領域。在進行醫藥分析時待分析物通常都比較大，親脂性強，雜質與活性成分具有相似的結構。許多分離方法都是采用高有機溶劑作為流動相來確保分析物被洗脫下來，同時采用有機改性劑避免峰拖尾，以達到預想的分離度。因此，以作者的經驗，至少在以穩定性為特征的純度分析中采用100% 的水溶液流動相或者完全消除有機溶劑是不可能的。隨著柱技術的進步，這些局限將會得到解決，溫度梯度液相色譜將會成為一種快速的分析方法，特別是針對前期的開發部門。此外，溫度梯度也能應用于其他方面。

        與等溫下的高溫分析相比，采用程序升溫對色譜柱的要求更為苛刻。即使在低于120℃的溫度下，氧化鋯基質的色譜柱在溫度梯度條件下固定相也會逐漸流失。不僅作者的實驗室觀察到了這個現象，其他的實驗室也有類似的報道^[8]。實際上，色譜柱的選擇是一個很大的障礙，特別是在醫藥分析領域。在進行醫藥分析時待分析物通常都比較大，親脂性強，雜質與活性成分具有相似的結構。許多分離方法都是采用高有機溶劑作為流動相來確保分析物被洗脫下來，同時采用有機改性劑避免峰拖尾，以達到預想的分離度。因此，以作者的經驗，至少在以穩定性為特征的純度分析中采用100% 的水溶液流動相或者完全消除有機溶劑是不可能的。隨著柱技術的進步，這些局限將會得到解決，溫度梯度液相色譜將會成為一種快速的分析方法，特別是針對前期的開發部門。此外，溫度梯度也能應用于其他方面。

3 結論

        在藥物分析中發展高溫液相色譜法非常有益。它有可能成為一種快速高選擇性的純度分析方法。由于采用了更高的溫度，因此可以獲得更高的柱效，從而使方法靈敏度得到改善。儀器方面的發展也使這種方法具有較好的重現性。色譜柱改進將使這種技術可能應用于常規實驗。

參考文獻

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