通過減少延遲體積輕松進行高通量分析的梯度優化

引言

　　RRHT 短柱非常適用于高效液相色譜（HPLC）梯度方法。1.8 μm 短柱（30 到50 mm）與常規的5 μm柱（ 100 mm 到250 mm ）相比，能在更高的流速下操作，因而再平衡更快。縮短再平衡時間是一種將梯度方法變成高通量梯度方法的關鍵策略。RRHT 短柱縮短了分析時間，也相應縮短了再平衡時間，原因很簡單，因為柱體積成比例減少。

　　除此之外還有其它的優點，改變梯度方法往往比改變等度方法更困難，因為改變后的色譜結果（例如，分離度）可能會和原來的梯度色譜圖不一致。這種現象在標準內徑（4.6 mm 內徑）過渡到窄內徑（2.1 mm內徑）梯度方法時尤為突出。難點是要減少從梯度起始點到在柱頭形成梯度之間的時間和體積。通常稱為延遲時間或延遲體積。延遲的差異導致在梯度過程中任意時間點上色譜柱中流動相組成不同。從而造成保留差異，感興趣色譜峰的分離度也可能不同。

　　本應用報告介紹了一種簡單的泵配置方法，可以減少延遲體積，改善低體積RRHT 梯度方法的色譜結果。

實驗

　　Agilent 高分離度快速液相色譜（RRLC）系統包括：

　　? G1365C 多波長檢測器（MWD）， 檢測波長254 nm，配置G1315-60024 微量流通池，響應時間設置0.5 秒

　　? G1312B 二元泵，流動相A：0.1% 甲酸水溶液(v/v)，B：0.1% 甲酸乙腈溶液(v/v)，流速：使用2.1-mm 內徑柱時1.5 mL/min，使用4.6-mm 內徑柱時5 mL/min。

　　柱溫為室溫，柱溫箱熱交換器用一根0.12-mm 內徑毛細管旁路連接。

　　ZORBAX RRHT 柱：

　　? Eclipse Plus C18, 2.1 x 30 mm, 1.8 μ，部件號59931-902

　　? Eclipse XDB-C8, 4.6 x 30 mm, 1.8 μ，部件號924975-906

　　樣品含尿嘧啶（20 μg/mL）和烷基苯酮（100 μg/mL）C3 到C10、C12 和C14，溶于50% 乙腈/水中。

結果與討論

高通量方法的關鍵點

　　在理想情況下，短柱能提供特定分析所需要的足夠分離度。對于小分子來說，主要通過調節流動相或梯度影響分離。RRHT 柱采用ZORBAX 1.8 μm 填料，與較長的常規5 μm 柱具有同樣的柱效。例如，4.6 x 250 mm 5 μm柱與4.6 x 100 mm 1.8 μm柱的理論塔板數(N)大致相同：

　　N 理想= L/2dp

　　在這里，L 是以微米計的柱長，dp 是以微米為單位的填料直徑。分母上的因子2 有時因存在降低塔板數的非理想因素（如，柱外體積）而發生改變（例如2.5)。

　　對于250 mm 長的柱：N理想= 250,000/2(5) =25,000 ；對于100 mm 的RRHT 柱N 理想=100,000/ 2 (1.8)= 27,778。

　　100 mm RRHT 柱的較短柱長直接使速度加快了2.5倍。另外，由于有RRHT 粒徑分布的專利設計，反壓比其它亞2 微米色譜柱更低。

　　開發高通量梯度分析方法的一般途徑是，縮短色譜柱再平衡時間和減少梯度延遲體積。

RRHT 短柱自動縮短色譜柱再平衡時間

　　填充1.8 μm 填料的短柱，即RRHT 柱，與更長的分析型色譜柱相比，明顯減少了柱體積。例如，4.6 x 150 mm 柱的體積大約為2.49 mL（不包含填料），而同樣直徑的50 mm 長的柱子則要小三分之二，即少用0.83 mL。2.1 x 30 mm 柱的體積只有0.10 mL，或比標準分析型柱小25 倍左右；因此，柱子再平衡可能少用25 倍的流動相，即少用25 倍的時間。ZORBAX 80-? 填料置換柱體積使真實體積減少了大約60%。填充后的4.6 x 150 mm 柱體積大約為2.49 mL x 0.60 =1.5 mL，而2.1 x 30 mm 填充后的柱體積為0.1 mL x 0.60 = 0.06 mL，體積仍小25 倍。

　　假設色譜柱再平衡到起始流動相條件需要5 倍的柱體積。ZORBAX 4.6 x 150 mm 柱，在1 mL/min 流速下操作時，5 個柱體積x 1.5 mL/柱體積= 7.5 m，7.5 mL / 1 mL/min = 7.5 分鐘再平衡時間。

　　而RRHT 柱再平衡則快得多：

　　? 2.1 x 30 mm：5 個柱體積x 0.06 mL/柱體積=0.3 mL，0.3 mL / 0.2 mL/min = 1.5 分鐘再平衡時間

　　? 4.6 x 30 mm：5 個柱體積x 0.3 mL/ 柱體積=1.5 mL，1.5 mL / 1 mL/min = 1.5 分鐘再平衡時間

　　實際上，由于1.8 μm RRHT 短柱可以在更快的流速下操作而不會損失柱效，RRHT 的再平衡時間還可能更短。

用小體積RRHT 柱進行梯度分析需要低延遲體積

　　為了保持色譜柱線性流速一致，2.1 mm 內徑方法的流速通常比4.6 mm 方法低5 倍(4.8 X)：

　　F2 = F1 (id2/id1)²

　　F2 和F1 是新流速和現有流速，id2 和id1 分別為色譜柱內徑。因為流速與內徑的平方成正比，所以從4.6減少到2.1 mm，流速大約減少5 倍。

　　在梯度方法中，延遲時間（從梯度開始到柱頭形成梯度所用的時間）將延長5 倍。因為4.6 和2.1 內徑這兩種色譜柱都是在零時間進樣，使用2.1 內徑柱時，樣品在等度條件下在色譜柱中移動的時間要長5 倍，直到梯度到達柱頭。因為延遲時間有5 倍的差異，導致色譜結果有很大不同。

　　有兩種縮短延遲時間的辦法：在更高的流速下操作，或者減少預柱體積，使梯度更快到達色譜柱。

　　有各種選擇可能減少1200 HPLC 系統的延遲體積，包括：

　　? 用0.12-mm 內徑管線取代0.17-mm 內徑管線

　　? 用一根短毛細管， 或低擴散熱交換器工具包(G1316-80003 帶G1316-83200)，旁路連接柱溫箱中的標準熱交換器

　　? 對自動進樣器編程，使樣品定量環和流量計旁路連接（自動延遲體積降低ON）

　　? 將二元泵從標準延遲體積配置改為低延遲體積配置

　　使G1312B 二元泵在標準延遲體積和低延遲體積之間轉換很簡單[1]，只需要1/4和9/16扳手，以及兩張示意圖（圖1a 和1b）。用一把1/4開槽螺絲刀(PN 05023-0240)將毛細管連接到壓力傳感器上。

　　從圖2 和圖3 中可以看出延遲體積最小化的結果。

　　圖2 是在2.1 x 30 mm RRHT Eclipse Plus C18 上開發的烷基苯酮RRHT 梯度方法，將二元泵配置標準延遲體積和低延遲體積的結果進行比較。雖然，按照慣例規定梯度從零時開始，0.5 分鐘內升至100%，但實際上，柱前體積使梯度在到達色譜柱之前有明顯的延遲。從流出色譜柱時變寬的色譜峰（峰1 到10）可以看出這一點。大約0.5 分鐘后，梯度接觸到進入的樣品，才使峰10 到12 的峰形變窄。在低延遲體積配置中，最早洗脫的峰仍在等度延遲當中，但后面的峰都更窄了，說明梯度更快地達到了柱頭。配置低延遲體積后，總分析時間縮短了30 ％。

　　圖３是用4.6 x 30 mm RRHT Eclipse XDB-C8 代替2.1 x 30 mm Eclipse Plus C18 柱的結果。流速為5 mL/min，所以標準延遲體積和低延遲體積在延遲時間上的區別比較小。峰的展寬不如2.1 內徑方法那么明顯，但泵采用了低延遲體積配置后，分析時間仍有14% 的差別。

固定相的選擇性可以影響分析速度

　　不同的固定相（Eclipse XDB-C8 和Eclipse Plus C18相比）也能縮短保留時間，盡管比2.1 內徑EclipsePlus C18 在更低的流動相線性流速下操作。將圖2 和圖3 比較，分析時間從0.9 分鐘縮短到0.6 分鐘，由于使用了更短的烷烴鍵合相，使通量明顯提高。擁有各種固定相是快速改變保留、選擇性和分離度的有益工具。現在有大量不同柱長、內徑的1.8 μm 固定相，可以用來優化高通量方法。

低體積靜態混合器選件

　　在許多情況中，有機溶劑低百分比混合洗脫（< 20%）在低延遲體積模式下可能出現基線異常的情況，這是流動相組成中UV 吸收的差異造成的。這種現象為波浪式基線。其它類型的檢測器如質譜儀（MSD）不受影響。要最大限度地減少這種影響， 可以使用200 μL 靜態混合器（部件號5067-1565），并結合SL型二元泵固件升級（A.06.06 [001]）。這種固件經過優化，適用于使用200-μL 混合器，不帶阻尼器。該固件將泵的沖程從20 降到10 μL。在水和乙腈中有很強不同UV 吸收的一個流動相組分就是三氟乙酸（TFA）。圖4 顯示了低體積柱和低有機相梯度未用混合器和固件A.06.06 [001]的結果。在梯度的高水相部分，沒有混合器/固件時，基線噪音非常大。

　　在許多案例中，流動相中沒有強差異吸收的成分。圖5 比較了不同的1200 SL 型配置對抗菌素氯林可霉素及其前體林可霉素的分離。由于這兩個化合物的疏水性差異很大，所以需要采用低有機相梯度（10 到40% MeOH/2 分鐘）使它們在合適的時間被洗脫。因為缺乏生色團，采用低UV 波長（205 nm）檢測，選擇小體積柱（2.1 x 30 mm）進行快速分析，使用與小體積柱匹配的微量流通池。上圖是在1200 SL 系統低延遲體積模式下獲得的，帶SL 型二元泵固件(A .06.04 [002])，旁路連接混合器和阻尼器。盡管和圖4 中產生波浪式基線的條件類似（低有機相梯度，小體積柱和低UV 波長檢測），但沒有出現基線異常。下圖采用了200 μL 混合器，與SL 型二元泵固件(A.06.06 [001])一起安裝。正如所預料和圖中計算的一樣，混合器的體積使延遲體積增加。由于第1 個峰在等度延遲階段洗脫，所以兩個例子中第1 個峰的保留時間都一樣。

　　輕松測量并改變延遲體積，在不同HPLC 儀器配置之間互相轉移梯度方法，或用RRHT 柱將方法轉換成更快速方法時，是一種有用的工具。圖6 顯示了幾種選件。另外，連接或斷開脈沖阻尼器，可以形成多種組合，適用于任何特殊梯度方法的最佳混合和/或最短或最佳匹配延遲體積等。

結論

　　小體積RRHT 柱對高通量梯度方法非常有用，因為與更大體積的分析型色譜柱相比，快速再平衡可以使分析通量顯著提高。

　　減少延遲體積是縮短分析時間、提高梯度通量的另一個途徑，尤其是對于2.1 mm 內徑色譜柱。在G1312B 二元泵中配置低延遲體積流路，可以使梯度流動相組成更快到達色譜柱，使等度延遲期或延遲時間最短。最終獲得更窄的色譜峰和更快的分析。

　　最后，能選用不同固定相色譜柱也是一種優勢，因為可以明顯改變選擇性、保留時間，還可能進一步縮短分析時間，最終提高實驗室效率。