傅里葉變換紅外光譜法檢測蛋白質的穩定性

摘要：在儲存和處理過程中，蛋白質的降解是生產和研究中的一個重要問題。要想解決這一問題，并不需要對蛋白質結構進行詳細分析，只需要簡單、快速地判斷蛋白質“好”或“壞”即可。如果對數據的采集加以關注，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）就可以便捷地給出這種判斷。本文系統地闡述了傅里葉變換紅外光譜在相關應用方面所面臨的挑戰、局限性和潛力，并以牛血清白蛋白由于溫度引起的變性為例加以說明。

Abstract：Protein degradation during storage or processing is a major concern in both manufacturing and research. Generally a detailed structural analysis is not required; a simple“good/bad”determination is all that is needed. When proper care is exercised in the data collection, Fourier transform. infrared spectrometry can provide this information. The challenges, limitations and the potential usefulness of FTIR for this kind of determination are outlined, and an example is provided involving the temperature-induced changes in bovine serum albumin.

1 前言

        在儲存和處理過程中，蛋白質的降解是生產和研究中的一個重要問題。要想解決這一問題，并不需要對蛋白質結構進行詳細分析，只需要簡單、快速地判斷蛋白質“好”或“壞”即可。如果對數據的采集加以關注，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）就可以便捷地給出這種判斷。本文系統地闡述了傅里葉變換紅外光譜在相關應用方面所面臨的挑戰、局限性和潛力，并以牛血清白蛋白由于溫度引起的變性為例加以說明。

2 蛋白質的表征

        蛋白質可以用四級結構來表征：一級結構--蛋白質肽鏈的氨基酸序列；二級結構--肽鏈中的規則區域；三級結構--規則和不規則區域的折疊；四級結構--多肽鏈的空間組合。一個蛋白質分子中所有氨基酸的酰胺鍵皆相同，但是每一個氨基酸殘基所處的分子狀態取決于其在結構中的位置，特別是二級結構。蛋白質分子中，空間上相鄰的氨基酸可以通過氫鍵作用形成二級結構，例如α - 螺旋、β - 折疊、β - 轉角和無規則卷曲。

        在紅外線照射下，分子中的化學鍵可以被激發，從而產生振動。對于二級結構為什么會影響分子的紅外光譜和拉曼光譜，已有文獻詳述^[1]。簡而言之，分子所處的狀態（例如氫鍵結合）就像吉他的調音柱所起的作用一樣，會輕微地改變分子中化學鍵的振動頻率。很多文獻論述了氨基酸振動頻率和各種二級結構之間的關系^[2]。盡管這些方法都有一定的局限性^[3]，但是蛋白質結構會影響其紅外光譜的事實卻得到了很好的證明。

        蛋白質中令人感興趣的振動主要是酰胺Ⅰ帶的伸縮振動（大約在1650 cm-1），由酰胺基團O=C-N 產生，其中的氧原子和氮原子都會生成氫鍵。這樣就可以依此推斷二級結構對分子振動的影響。遺憾的是，液態水和氣態水在這一區域也有振動，消除這兩種干擾是蛋白質紅外光譜分析所面臨的最大挑戰。

        已經發展了一些避免水峰干擾的方法。向紅外光譜儀中通入氮氣或者干燥空氣以去除水蒸氣，或者采用數碼手段處理數據皆是消除水峰干擾的有效途徑。吹掃等物理的去除方法應優先考慮，因為任何的數字處理都會使分析結果偏離原始數據。使用D₂O（氘的振動相對酰胺Ⅰ帶有一定的位移）作為溶劑來去除水峰的效果很好，但是這一方法費用昂貴，而且不方便。

        上面這些問題在圖1 和圖2 中得到了很好的例證。圖1 是水相緩沖液中牛血清白蛋白（BSA）、水蒸氣和緩沖液的光譜圖，以及BS A 與緩沖液的光譜圖的差譜圖，所有的譜圖坐標相同（已扣除背景）。蛋白質的信號很小，相對于緩沖液的1.5 個單位的吸光度，蛋白質只有0.02 個單位的吸光度，而且與水峰的交疊非常明顯。

        圖2 證明了不同溫度對水峰的影響。在對蛋白質穩定性進行研究時通常比較關注溫度的影響，但是在扣除緩沖液光譜的過程中，如果緩沖液光譜圖在室溫下測得，而蛋白質的光譜圖是在其他溫度下測得，由于水峰的位移和峰形的改變，會讓得到的結果毫無意義。

3 實驗部分

        將牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）溶解在Tris 緩沖液中（0.05 mol/L Tris, 0.05 mol/LNaCl, 0.0005 mol/L 乙二胺四乙酸［EDTA］，pH7.2），質量濃度為4mg/mL。Nicolet^TM 6700 紅外分光光度計（Thermo Electron Corp．，Madison，WI），中紅外光學系統（KBr 分束器，氘化三甘氨酸硫酸脂［DTGS］檢測器），配套的Proteus 蛋白質分析模塊。溫度控制附件用干燥空氣吹掃過夜。樣品裝在6- μm通路長度的樣品池中，窗口材料為CaF2。Proteus分析模塊提供的@Temp^TM 部分用來收集光譜數據，從5 ℃到80 ℃，每5 ℃一個臺階。每個溫度臺階有5 min 的平衡時間，256 次掃描，4 cm-1的分辨率。OMNIC^TM 光譜軟件用來分析和處理數據，包括峰特征解析。Proteus 分析模塊的使用手冊^[4]中提供了優化實驗和分析的必要信息。結果最后輸出到Microsoft Excel 中做最后處理。

4 結果和討論

        溫度升高可以引起氫鍵斷裂。由于蛋白質的二級結構靠氫鍵作用形成，因此氫鍵的斷裂可以引起蛋白質的微小或者可能是徹底的結構變化。這種改變將會使蛋白質的功能喪失。

        牛血清白蛋白是血液中一種脂肪酸和其他非水溶性物質的轉運蛋白。這種蛋白有54% ~ 68%的α - 螺旋^[5]，剩下的是轉角和無規則卷曲（無β - 折疊）。與其相似的人源蛋白（HSA）呈心形的3D結構，至少有5個轉運脂肪酸的“溝槽”。

        圖3 給出了牛血清白蛋白在高溫和低溫下的光譜圖，即使不作進一步的分析，也可以看出變化非常明顯。有很多方法可以從中提取有用的信息。分析方法的選擇取決于使用者是想獲得簡單的定性信息（蛋白質是否變質）還是欲獲得蛋白質二級結構的詳細信息。

        首先， 使用例如曲線擬合的光譜分析技術，用文獻^[4]中所提供的相關度表格，可以提取特定蛋白質二級結構相關的信息。用這種方法處理BSA 的光譜圖，結果見圖4。在這之前，需要選擇已知結構的蛋白質作為參考，確定合適的擬合參數和變量。擬合峰的峰面積與各種螺旋、折疊的“濃度”成比例，因此可以計算出各種二級結構所占的百分比。

        另外，可以把蛋白質的光譜圖同數據庫中已知的各種二級結構所占百分比的蛋白質圖譜進行比較。包含相關蛋白質信息（例如：α - 螺旋，β - 折疊的含量）的紅外光譜數據庫，可以用化學計量學程序包，例如TQ Analyst 軟件（Thermo Electron Corp．）來建立。不管用哪一種化學計量學方法，結果的可靠性取決于所輸入數據的可靠性。必須有足夠的有關二級結構信息，才能最大限度的保證模型的適用性。可以采用多種算法（例如偏最小二乘法）來計算，建立普適的方法。

        采用一種簡單的方法就可以研究蛋白質的降解。這里，我們僅建立一個感興趣的蛋白質的數據庫，其中一些目標參數，例如反應產率、酶活性等按標準狀況下設定。只要和數據庫中的圖譜進行對照，就可以直接預測蛋白質性質的變化情況。圖5 是運用化學計量學方法處理BSA 數據的結果。通過曲線擬合可以計算出α - 螺旋的含量。數據利用TQ Analyst 軟件進行交互確認。良好的相關度表明數據具有很好的內在一致性，以及在蛋白質性質預測方面的良好前景。

        蛋白質的相關度表和化學計量學分析必須謹慎使用。一些蛋白質，例如聚-L - 賴氨酸，其表現和大多數的蛋白質不同。Jackson 和Mantsh^[3]討論過有關錯誤使用紅外光譜的問題，并且建立了相關分析的限定條件。總之，評價蛋白質的變性很容易，但是不可能給出絕對的構象變化信息。

5 結論

        FTIR 在快速、簡單地提供有關水溶液中蛋白質質量控制信息方面有很大的潛力。通過一系列標準化處理過程，獲得的數據可以顯示處理過程中蛋白質是否變性，而不用通過結晶或是濃縮的方法測定。數據分析所用的方法取決于想獲得哪一方面的信息，對于特定蛋白質或許需要專門設計的方法測定。Proteus 分析模塊對于不熟悉FTIR 的使用者來說也很容易操作。

參考文獻

1. Bradley, M. Thermo Electron Corp. Application Note AN 50733, “Curve Fitting in Raman and IR Spectroscopy: Basic Theory of Line Shapes and Applications”; 2004.
2. Oberg, K.A.; Ruysschaert, J.-M.; Goormagtigh,E. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 2937-48.
3. Jackson, M.; Mantsch, H.H. Crit. Rev.Biochem. Molec. Biol. 1995, 30(2), 95-120.
4. Bradley, M.S.; Nishikida, K. Infrared Measurements of Proteins: Theory and Applications.
   Booklet included in Proteus protein analysis kit (not available separately), 2005.