用配置亞2 微米粒徑色譜柱的液相色譜儀改進對生物樣品中代謝物的分離

引言

　　在藥代動力學(DMPK)研究中，體外和體內實驗的目的都是鑒定與藥物相關的組分[2,3]。當某些特殊代 謝物只用LC-MS 鑒定還不夠，需要更多結構信息時，用LC 分離就成了關鍵步驟，要為核磁共振（NMR）分析等其它鑒定方法提供樣品。代謝物要從各種復雜基質中分離，如血漿、尿液、糞便、肝臟和膽汁。在亞2 微米小粒徑柱提供的快速和高分離度的推動下，對常規HPLC 方法重新評價，是否能作為一種縮短代謝物分離時間的方法[4, 5]。

實驗

高分離度快速液相色譜

　　用一些實驗來確定， 在高分離度快速液相色譜（RRLC）系統上用1.8 微米色譜柱是否改善了色譜分離。所用的RRLC 系統見圖1。
　　? 1200 系列SL 型二元泵，配置微量真空脫氣機
　　? 1200 系列高性能自動進樣器
　　? 1200 系列柱溫箱
　　? 1200 系列高速可變波長檢測器
　　? 1100 系列分析級餾分收集器

　　色譜柱采用幾種不同柱長和填料粒徑的ZORBAX SBC18。為了保持恒定的樣品加載量和流速，內徑固定在4.6 mm。要獲得合適體積的餾分，流速設置約為1 mL/分鐘。所用色譜柱的詳細情況如下：
　　? 4.6 x 250 mm, 5 μm, 部件號880975-906
　　? 快速分離4.6 x 150 mm, 3.5 μm，部件號863953-902
　　? 快速分離高通量4.6 x 150 mm, 1.8 μm，部件號829975-902
　　? 快速分離高通量4.6 x 100 mm, 1.8 μm，部件號828975-902

　　相關的方法參數包括：流動相A: 10 mM 醋酸銨，用醋酸調至pH 5.0，流動相B：75:25 乙腈: 甲醇。可變波長檢測器(VWD)檢測波長235 nm，峰寬設置> 0.005 分鐘，或0.12-秒響應時間，配置標準流通池(部件號G1314-60086)。

　　原方法(4.6 x 250 mm 柱)的梯度表如下：

　　快速分離（RR）和快速分離高通量（RRHT）柱越短，時間將成比例地縮短。

樣品

　　尿樣的分析結果見圖2 和圖3。尿液樣品的制備包括，取10 倍量的尿液在室溫下真空離心干燥濃縮，然后用起始流動相復溶。進樣前，樣品再次離心，去除微粒。這種方法也可以用于血漿、肝臟勻漿和糞便勻漿。樣品制備包括，用三倍體積的溶劑（1:3，樣品：乙腈）旋渦混合分別提取三次，并離心。取出上清，混合，干燥。提取物用起始流動相復溶，離心，然后進樣。在大多數情況下，膽汁可以不經過樣品制備直接進樣。

　　尿樣分析的結果見圖1 和圖3。鑒定出的感興趣藥物代謝物為色譜圖中的M5、M13、M15 和M17。

結果與討論

　　在我們實驗室里， 因為待測樣品的復雜性， 用4.6 mm x 250 mm, 5 微米柱進行色譜分析的時間，可能在60 分鐘到3 個小時。本研究的目標就是要用現有的方法，在保持分離度和測試量的同時，縮短分析時間。

　　每次進樣加載物質的量部分地決定了所用的柱內徑。通常，感興趣的代謝物以每毫升納克到微克水平存在于基質中，大量內源性物質占樣品中的絕大部分。為了從內源性物質中獲得最大量的代謝產物，經常要使色譜柱超載。大量內源性物質加載到色譜柱上，導致超載，影響色譜分離的完整性。要減少內源性物質與感興趣代謝物的共洗脫，必須采取少量多次進樣。對這種長達1 小時的分析，多次進樣只分離非常少量的物質，顯得相當浪費時間。雖然我們實驗室不要求高通量，但提高通量還是很重要。這里顯示的是用Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜快速分離柱得到的結果。代謝研究中經常要用14C 同位素標記化合物，將其作為一種有效方法，鑒定被內源性化合物背景掩蓋下的藥物相關物質。用亞2 微米色譜柱進行的這類研究將在以后的論文中發表。這里分析的是第一次從人體實驗得到的樣品，藥物沒有標記14C 同位素標記。為了分離制備，只監測和報告了UV 響應。

　　在圖2 中，顯示了對尿樣分析的比較，樣品中需要分離的代謝物水平非常低。原來在ZORBAX SB-C184.6 mm x 250 mm, 5 μm柱上建立的方法，分析時間為60 分鐘。本樣品在用于比較的4.6 mm x 100 mm,1.8 μm柱和4.6 mm x 150 mm, 1.8 μm及3.5 μm柱上分離。梯度曲線按柱長比例更改。

　　正如所期望的，隨著粒徑和柱長的減少，分離度和UV 響應都有了增加。對每根色譜柱每種代謝物UV響應和峰寬的比較見表1。每種代謝物的峰形都有明顯改善，可以看到理論塔板數的增加。請注意，如果用更小的2.1 μm 內徑柱，柱效還有可能進一步改善。

　　圖2 還顯示了方法的耐用性和用SB-C18 的可縮放性。不同的柱子配置，包括粒徑和長度，對選擇性的影響很小。從四種分離都具有相同的洗脫曲線就可以看出這一點。由于為了每次分析純化出最大量的代謝物，有意識地讓色譜柱超載，所以感興趣的峰有拖尾現象。

　　用RRHT 4.6 x 100 mm 柱取代常規的4.6 x 250 mm,5 μm 柱時，同樣的進樣量，峰高平均增加了46%，峰寬變窄了44%。從而最大限度地減少了分離制備時峰的重疊，不再需要合并餾分。另外，分析時間也縮短了一半。這一優勢使實驗室效率有所提高。

　　將流速從1 mL/min 增加到1.5 mL/min，進樣量從100 μL 減少到50 μL，將進一步提高柱效。圖3 是將圖2 中的RRHT 方法稍微進行了優化，重疊現象有所改善。分析速度快了3.8 倍，峰形也有所改善。1.5 mL/min 分析時的系統反壓（最大）為464 bar，1 mL/min 分析時為315 bar，兩者都在Agilent 1200RRLC 的操作范圍內(600 bar)。ZORBAX 1.8-μm填料的粒徑分布經過了專門設計，壓力比其它亞2 微米填料更低。

結論

　　結果表明RRHT 技術提高了實驗室的效率。用RRHT柱取代常規色譜柱，在不影響分離度的情況下，提高了通量。最大的收獲是用更小粒徑(1.8 或3.5 um)色譜柱，分離度的提高最大。用RRHT 柱取代了常規尺寸色譜柱后，峰高和峰寬都有了改善。另外，分析時間與柱長成比例地縮短。這些優點將帶來實驗室效率的提高。本方法在對復雜基質進行分析時（例如，尿和血漿）很容易在不同配置的SB-C18 柱（包括不同的粒徑）之間放大和縮小，最大限度地簡化了樣品制備。