淺析糖基化修飾對抗體藥物免疫原性的影響

抗體藥物是一種具有市場潛力的生物技術藥物，據一些資料顯示2010年全球銷量前10位的藥物中有4個是單抗類藥物，2011年抗體類藥物銷售額達480億美元。然而抗體藥物在取得良好治療效果的同時，也可能會引發不同程度的過敏反應和抗抗體反應，即人體對外源免疫球蛋白的免疫反應。進行抗體藥物的免疫原性試驗，可以考察抗體藥物的免疫原性強弱。通過抗體藥物的免疫原性試驗，并研究糖基化修飾對抗體藥物免疫原性的影響，為研發免疫原性低的創新性抗體藥物提供科學依據。

抗體藥物作為外源性蛋白，不可避免地會激活機體自身的免疫反應，誘導產生抗藥物抗體，從而嚴重影響其安全性和有效性。生物藥物的糖基化修飾對其結構和功能均有較大影響，進而影響藥物的免疫原性。一方面蛋白質表面的糖鏈可以誘發特定的免疫反應；另一方面，糖鏈又可以遮蓋蛋白質表面的某些表位從而降低其免疫原性。

抗體藥物的免疫原性試驗可以采用抗藥抗體（anti-drug antibody， ADA）分析的方法進行。分析技術包括ELISA、ECL、SPR、RIA、MSD等，可靈活采取一種或幾種組合，目前常用的技術是ELISA和MSD。試驗設計為多步檢測法，包括篩選、確證、滴度和中和試驗。美迪西生物分析服務部門的服務內容涉及藥代動力學、藥效學、免疫原性和生物等效性等研究方面，可以為客戶提供小分子藥物、生物制劑、疫苗和生物標記物的篩選與開發，以及臨床前和臨床研究。

糖作為生命體重要的物質結構之一廣泛地參與了各種生物學功能，其中蛋白糖基化修飾是糖結構的一種重要存在形式。大于50%的哺乳動物蛋白和超過70%的生物蛋白類藥物都具有糖基化。糖基化參與了蛋白折疊、跨膜轉運、細胞粘附、免疫應答等一系列蛋白功能。單克隆抗體藥物的糖基化與藥物療效、藥物代謝、藥物穩定性與免疫原性等成藥性關系密切。糖基化修飾可以促進單抗產品的穩定性和可溶性，并且可以減緩形成聚體的趨勢。有研究者將IFN糖基化后，其免疫原性會有所降低。還有研究者對rh-GM-CSF進行糖基化后，也得到了類似的結果，推測可能是糖基側鏈遮蔽了生物大分子產生免疫原性的活性位點。

1、糖基化修飾在Rsα、AhcY免疫原性試驗上的研究

研究者研究了糖基化修飾對Rsα、AhcY免疫原性的影響，首先通過誘導生產菌BL21表達得到Rsα和AhcY蛋白。經過親和層析純化后，Bandscan估算蛋白純度。利用EDC/NHS化學偶聯法對Rsα和AhcY蛋白進行六種甘露糖修飾。BCA法和酚硫酸法分別測定蛋白和糖的摩爾濃度，確定蛋白和糖鏈反應摩爾比。FITC熒光標記甘露糖修飾蛋白后作用Raw264.7細胞，以熒光顯微鏡觀察吞噬蛋白的速度結合流式細胞術測定被吞噬蛋白的量。收獲的糖修飾蛋白混合弗氏佐劑免疫Balb/c小鼠:MTT法測定免疫后第四周的脾淋巴細胞增殖；糖蛋白刺激免疫鼠脾細細胞因子分泌水平測定；間接EILSA法檢測小鼠第二周到第八周血清抗體效價。Western Blot檢測脾細胞表面TLR2、TLR4受體表達情況。

結果發現六糖修飾的AhcY蛋白被受體識別速度比原蛋白快、免疫原性顯著提高。二糖修飾AhcY后蛋白免疫原性顯著性提高。五糖修飾Rsα蛋白、四糖修飾的AhcY蛋白受體識別明顯加快。

2、糖基化修飾可以降低抗體藥物的免疫原性

研究發現，單克隆抗體Fc段CH2結構域含有一個保守的糖基化位點，即Asn-297。Asn-297糖鏈由核心七糖連接一些末端糖組成，末端糖是高度可變的多糖。Asn-297的糖基化對于抗體結構的穩定和抗體能否達到最佳療效具有重要的作用。當人源抗體IgG1的Asn-297位點突變為GIn297后，抗體在溫度升高時結構不穩定，比較容易形成蛋白多聚體。   西妥昔單抗Fab片段的糖鏈中α-1-3半乳糖的存在與否與其過敏反應的產生有密切的關系，當利用無α-1-3半乳糖糖基化修飾的細胞系生產西妥昔單抗時，得到的產物免疫原性較低。

單抗藥物是當前發展較為迅速的蛋白類藥物之一，作為大分子糖蛋白藥物，單抗藥物的糖基化修飾對其穩定性、有效性和安全性等各方面均有不同程度的影響，因此對其糖基化修飾進行全面表征具有十分重要的意義。藥物引起的免疫反應是藥物安全性和有效性的重要指標，這也是監管機構、生產企業、臨床醫生和患者共同關注的。在抗體藥物的非臨床研究中進行免疫原性試驗，并開發可靠的能夠有效評估抗藥抗體反應的實驗方法至關重要。