T/CSBM 0022-2022
可降解鎂基金屬骨植入部位的降解、成骨與組織反應的評價方法
Evaluation method of degradation, osteogenesis and tissue response of degradable Mg-based metal at implant site
- 標準號
- T/CSBM 0022-2022
- 發布
- 2022年
- 總頁數
- 11頁
- 發布單位
- 中國團體標準
- 當前最新
- T/CSBM 0022-2022
- 適用范圍
- 1 試驗設計 1.1 概述 本方法系將醫用可降解鎂基金屬骨植入物植入到試驗動物骨組織內一定時間后，在試驗的不同時間點，通過影像學和組織學檢查，結合圖像定量分析，對可降解鎂基金屬骨植入物的降解性能、成骨能力及植入后局部組織反應進行評價。 注∶在進行體內降解試驗前宜先按照GB/T 16886.15的要求對植入物進行定性與定量分析。 1.2 樣品的制備 1.2.1 試驗樣品 1.2.1.1 試驗樣品的物理特性（如形狀、表面粗糙度等）可影響材料的降解性能。 1.2.1.2 每一個試驗樣品都應經過與最終產品相同的制造、處理、清潔、滅菌及包裝過程。 1.2.1.3 樣品制備和滅菌后，應特別注意在植入前或植入過程中不使其受到擦傷、損壞或任何污染。 1.2.2 參照樣品 可考慮選擇已上市的與目前尚無公認的、適用于可降解鎂基金屬對照的材料，或與待選可降解鎂基金屬預期用途一致的、已經被臨床所接受的同類材料以評價植入后局部的組織學反應程度，比較材料的降解速率和新骨生成率。 1.2.3 樣品形狀 植入樣品可加工成圓柱形、螺釘狀或刻有螺紋。 1.2.4 樣品尺寸 根據所選用動物及其骨組織的大小來決定植入樣品的尺寸。 注∶原則上應參考GB/T 16886.6-2015的規定，推薦兔脛骨或股骨部位植入，選用直徑為2 mm，高為6 mm的圓柱體。 1.3 實驗動物和植入部位 1.3.1 實驗動物 1.3.1.1 應按照GB/T16886.2和實驗動物的國家法規要求選擇實驗動物并進行飼養，實驗動物應自由獲取食物和水。 1.3.1.2 骨內植入試驗所需時間較長，一般首選新西蘭兔，體重不小于2.5kg，雌兔應無孕。 1.3.1.3 應選擇足夠數量的動物以保證每種檢查（脫鈣和不脫鈣）的每一試驗周期至少能獲得10個試驗樣品和10個參照樣品的標本數。 1.3.2 植入部位 1.3.2.1 推薦參照GB/T 16886.6-2015規定選擇兔的脛骨或股骨部位作為植入部位，也可以考慮模擬臨床使用部位或其他適宜的部位。 注∶模擬臨床使用部位或其他適宜的部位須滿足7.1.2分析要求。 1.3.2.2 試驗樣品與參照樣品（若有）應以相同條件分別植入到同一動物的兩側相同解剖部位。選擇植入部位時，應確保植入手術不會造成試驗部位病理性骨折，對年幼動物應避免將植入物植入到骺區或其他未發育成熟的骨內。 1.4 試驗周期 1.4.1 試驗周期的確定應根據試驗樣品的預期用途和降解性能而定。體內動物試驗前應事先評估試驗樣品的降解時間，降解時間可通過體外降解試驗或特定環境下的數學模型來推算。原則上試驗周期應至少（但不限于）設置3個觀察時期，一般應長于試驗樣品降解和被吸收的時間，或試驗周期應能使相應的組織反應達到一個穩定狀態。通常應至少（但不限于）設置以下3個時間點∶ a） 沒有或僅有極少量降解； b） 降解過程，推薦包括植入物剩余量約為50%時的時間點； c） 組織反應處于穩定狀態或植入物幾乎完全降解。 1.4.2 植入物的降解率及周圍組織結構的改變隨時間而變化。對于預期在12周內幾乎完全降解的材料，建議選擇1周、4周、12周為觀察期。 1.4.3 對于預期超過12周完全降解或達到降解穩態的材料，可參考上述原則，依據植入物的降解特性酌情選擇試驗周期。 2 試驗方法 2.1 手術過程 2.1.1 在麻醉和無菌條件下，按常規外科手術要求進行如下手術過程∶ a） 于股骨外側或脛骨內側部位備皮、消毒、鋪巾； b） 切開皮膚，分離皮下組織，沿肌肉間隙暴露骨皮質； c） 用低轉速間歇地鉆孔，同時用生理鹽水沖洗降溫。對于脛骨或股骨部位，一側鉆2個孔，最多3個孔，深度與植入物的長度接近，孔徑為2mm，兩孔間距不小于10mm； d） 清除骨屑； e） 將樣品輕輕按壓植入，使樣品表面平于或略低于骨皮質表面，螺紋狀植入體旋入孔內； f） 逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。 2.1.2 參照樣品與對側同法操作。 2.2 術后臨床觀察 2.2.1 植入后2周內應每天觀察植入部位的皮膚反應情況，有無出血、紅腫、氣腫和植入物排出等異常現象。 2.2.2 在試驗期內定期觀察動物的健康狀況，記錄任何異常發現，包括局部反應及異常行為。 2.2.3 記錄死亡的動物數并及時進行尸檢，垂死動物及時隔離并處死。 2.3 動物處死 觀察期結束時用過量麻醉劑無痛處死動物。 2.4 大體觀察 2.4.1 目視或用低倍放大鏡觀察植入部位組織，記錄觀察到的組織反應的特性和程度，包括血腫，水腫，纖維包裹和/或任何大體發現。記錄可觀察到的植入物狀態，包括表面形態、位置、完整性和殘留情況等。 2.4.2 在觀察植入部位時，如果動物表現出現病態或對植入物的異常反應，必要時應進行大體尸檢。 2.5 取材及組織病理切片制備 2.5.1 基本要求 2.5.1.1 切取的組織標本應包括植入物及其周圍足夠多的未受到影響的組織。 2.5.1.2 對切取的組織塊進行固定，分別采用脫鈣和不脫鈣2種制片技術制備組織病理切片，以評價植入后局部的組織學反應以及材料的降解和新骨的生成情況。2.5.2 常規組織病理切片制備（脫鈣） 含植入物的骨組織塊取材后應立即置于10%甲醛液及其他適宜的固定方式固定2周后，置于合適的脫鈣液中脫鈣，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，垂直植入體長軸進行常規制作病理切片，HE 染色。 注：脫鈣液如EDTA。 2.5.3 硬組織病理切片制備（不脫鈣） 2.5.3.1 含植入物的骨組織塊取材后應立即置于70%酒精固定1周~2周，然后梯度酒精脫水、二甲苯透明、甲基丙烯酸甲酯溶液滲透1周、聚甲基丙烯酸甲酯包埋。固化后，采用硬組織切片機在皮質骨纖織區域內垂直于植入物的長軸進行切片。研磨拋光至厚度為50μm±10μm，最后使用V-G酸性品紅染色，或采用其他適宜的染色方法。 2.5.3.2 同期，取一個未植入的試驗樣品，用聚甲基丙烯酸甲酯包埋，固化后采用硬組織切片機，垂直于試驗樣品的長軸進行切片，研磨拋光至厚度為50μm±10μm，用于植入物植入前的橫截面總面積的計算。 注∶在制作組織切片時，每一植入點切取皮質骨區。 2.6 影像學檢查 必要時，可采用Micro-CT影像學檢查分析金屬植入物的三維降解情況，根據設備情況，選擇合適的電壓、電流和曝光時間，其中有效像素尺寸應不低于10 μm。采用相應的軟件計算降解剩余金屬和新形成骨的體積。 3 結果評價 3.1 降解與成骨性能 3.1.1 定性分析 采用不脫鈣的硬組織切片，光學顯微鏡下觀察植入部位植入物是否發生降解和新骨生成，并觀察、描述編織骨、板層骨、骨髓等新骨的成熟度。 3.1.2 定量分析 3.1.2.1 植入物剩余量和新骨生成量分析 3.1.2.1.1 運用光學顯微鏡采集每張試驗樣品切片的圖像，運用圖像分析系統，計算植入物植入前的橫截面總面積。 注∶推薦ImageJ使用軟件進行分析。 3.1.2.1.2 采用不脫鈣的硬組織切片，首先選中植入區域，使其與植入物植入前的橫截面總面積等同，然后選中該區域內需要評價的殘余材料或新生骨組織，最后分別定量分析植入物剩余量以及新骨生成量，計算植入物降解率及新骨生成率。 注∶植入區以單個鏡下視野可完整覆蓋整個植入區域為準。 3.1.2.1.3 按式（1）進行計算植入物降解率（DR）∶ DR(%)=(1-RMV/IMV)×100%………………(1) 式中： DR————植入物降解率； RMV————植入物剩余量； IMV————植入物初始量。 3.1.2.1.4 按式（2）進行計算新骨生成率（RNBF）∶ RNBF(%)=NBFV/IMV×100%………………(2) 式中： RNBF————新骨生成率； NBFV——新骨生成量； IMV————植入物初始量。 3.1.2.2 植入物降解率平均值 按式（3）計算植入物降解率平均值∶ P1=SDR/10……………………………(3) 式中： P1————植入物降解率平均值； SDR————各植入點植入物降解率的總和。 3.1.2.3 新骨生成率平均值 按式（4）計算新骨生成率平均值∶ P2=SRNBF/10……………………………(4) 式中： P2————新骨生成率平均值； SRNBF——各植入點新骨生成率的總和。 3.2 局部組織學反應 3.2.1 組織學觀察（定性） 3.2.1.1 采用脫鈣的硬組織切片，在光學顯微鏡下觀察并比較試驗樣品與參照樣品周圍的組織反應。至少需要觀察的指標應包括∶ a） 植入物周圍氣腔形成; b） 肉芽組織、纖維化和纖維囊腔形成； c） 炎性反應程度： 1） 炎性充血； 2） 炎細胞浸潤的數量、分布及種類。 注∶炎細胞包括嗜中性白細胞、淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞及多核巨細胞。 d） 組織變性及壞死的存在、范圍及程度； e） 血管分布、脂肪浸潤及新骨形成。 3.2.1.2 采用不脫鈣的硬組織切片，在光學顯微鏡下，觀察的指標應包括∶ a） 材料的破裂和/或存在碎片、材料降解殘留物的形狀和位置； b） 植入物與周圍組織之間的界面； c） 材料周圍組織中氣腔形成情況。 3.2.2 組織學反應半定量分級 參照GB/T 16886.6-2015附錄E的組織學反應記分系統對試驗樣品的組織切片分別記分。 3.3 影像學分析 必要時，采用配套的軟件分析金屬殘留體積，并繪制金屬植入物體積與時間曲線。計算新生骨體積（V1）占骨質缺損區域（V0）的體積比例（△V），計算公式為: △V=V1/V0×100%……………………………………(5) 式中： △V——新生骨體積占骨質缺損區域的體積比例； V1————新生骨體積; V0————骨質缺損體積。 注1骨質缺損體積（V0）一般是指骨缺損修復前或骨缺損制備的體積，可根據缺損的尺寸大小計算或者參考空白對照計算獲得。 注2∶新生骨體積（V1）是指骨質缺損區域內灰度值在一定區間內的部分，新生骨灰度值區間需自行定義。設備不同、拍攝參數不同、拍攝樣品的大小和植入部位不同、植入材料的阻射值不同，其新生骨灰度值也不同，因此在計算新生骨體積時應盡量減少剩余材料的干擾。 4 試驗報告 試驗報告應包括詳細的數據資料，以能夠對結果作出獨立的評價。試驗報告應注明檢測機構和檢測日期，應報告下列項目: a） 植入樣品 1） 分別描述試驗樣品和參照樣品的外形、尺寸和數量； 2） 樣品的處理過程，包括所采用的清洗、處理和滅菌技術（若有）。 注∶如果樣品不是在本實驗室制備，在檢測開始之前，生產廠家應提供這些資料。b） 動物與植入 1） 動物的種屬、品系、來源、年齡、性別和體重，檢測期間的環境條件，動物飲食及動物狀況，以及檢測期間包括意外死亡在內的所有觀察發現； 2） 植入方法以及每個動物和每一部位植入物的數量。 c） 取樣與組織學制備∶ 1） 所采用的取樣方法，記錄每只動物、每一觀察期植入物取到的數量； 注:所有樣品都應作為試驗的一部分。 3） 植入部位的大體觀察，所采用的組織學切片制備技術。 d） 肉眼和顯微鏡觀察∶ 1） 每一植入物的觀察情況以及植入物周圍組織的大體外觀； 2） 詳細描述并比較評價脫鈣組織切片中的組織學反應及反應分級情況； 3） 分別報告試驗樣品和參照樣品（若有）的植入物降解率總平均值與標準差、新骨生成率總平均值與標準差、實驗組和對照組降解和成骨結果的統計學分析，以及新骨成熟度的典型病理圖片。 e） 結果評價∶報告應包括對可降解鎂基金屬骨植入部位的降解率、新骨生成率以及局部組織學反應作出總體評價。