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相關基礎知識 ? 1.DNA 片段的純化： DNA 純化的主要目的是回收得到純的 目的 DNA 片段，去除影響 DNA 連接酶活性的物質以及其 它的 DNA 片段。純化 DNA 片段的方法有多種，如：電洗 脫法、從低熔點或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、 柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推出了 直接從 PCR 產物中或瓊脂糖凝膠中回收 DNA 片段的試劑 盒，有效地加快了 DNA 的純化的速度。 ? 2.DNA 重組 ? DNA 重組本質上是一個酶促生化過程，是指將外源目的 基因片段通過 DNA 連接酶的的作用插入到質粒載體中的 過程。 DNA 片段只有與載體重組并轉入合適的宿主細胞 中才能進行復制。通過此方法可以對單個基因的功能進 行研究。結合 PCR 技術還可以應用于疾病診斷、合成具 有商業意義的產品，如胰島素、干擾素等 。 3.載體的選擇 ? ? 因為載體具有能夠在特定宿主細胞中獨立自我復制的復 制起始點，保證插入的外源片段的復制；并且具有多個 限制性內切酶的單一位點，即多克隆位點，用于插入外 源片段，而又不破壞質粒本身的結構；還具有易于篩選 和檢測的標記性基因，如抗藥性基因、酶基因或營養缺 陷型等。但針對不同的研究目，選擇的擇載體也是不同 的，不僅要考慮上述特性，而且還要考慮所選載體是表 達載體還是非表達載體、是真核生物表達載體還是原核 生物表達載體以及酶切位點等方面的問題。 ? 4.DNA 連接酶 ? 主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。 E. coli DNA 連接酶催化DNA分子連接的機理與T4噬菌體 DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是ATP而是NAD + 。 T4噬茵體DNA連接酶催化DNA連接反應分為三步。 ? T4 噬菌體 DNA 連接酶還有一種 E. coli DNA 連接酶沒有的特性即將兩個平末端的雙鏈 DNA 分子連接起來的功能。對于這種連接反應的機理目前還不清楚，總的來說這種連接的效率比粘性末端的連接效率要低得多，可能是因為平末端 DNA 分子無法形成類似粘性末端分子那樣的相對穩定的結構。 ? ? 詳細內容請見： 點擊瀏覽該文件 ? ? ? ? ? ?

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