從G418篩選，轉染到單克隆化的總結

我做了穩定轉染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。有自己的體會也有其他戰友遇到的情況，和大家分享. 沒有總結好的地方，大家補充。

篩選之前確定G418濃度：

1.由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。

2.G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。neo就是編碼3‘磷酸轉移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進行轉染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉轉染時不加其它抗生素。

3.匯合度對G418篩選結果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%

4.G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100μg/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106個細胞電轉后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內大約50%匯合度。理論上1/4000孔內應有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內有兩三個克隆，按比例1/300孔內應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。

加藥時間和維持濃度:

1.由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性，一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200μg/ml。

2.加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經得到表達。一般是轉染48小時后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。

關于維持濃度，有人說細胞會出現對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的的話，可以調整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。

篩選時的培養液:

加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：

1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液

2 .孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之后收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染后篩選過程中就可以應用這種培養基。

3.適當增加血清濃度。

篩選時出現的問題及其解決辦法：

1.問題1。做hela細胞的篩選，現在已經篩選3周，在6孔板中已經長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？

a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續作用1MIN，這時，消化酶可以繼續作用的，又可避免胰酶擴散；