二、脂質體介導DNA轉染法 ? 脂質體(lipofectin re geant,LR)試劑是陽離子脂質體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。 ? 用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量. ?作用時間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1～5 μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間(2～24小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。 ? 細胞種類：COS-7. ?BHK. ?NIH3T3. ?Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。 ? 1. ?操作步驟[方法一]： ? (1)：取6孔培養板(或用35 mm培養皿)，向每孔中加入2 mL含1～2×105?個液，37 ℃ CO2?培養至40%～60%匯合時(匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。 ? (2)轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養基稀釋1-10 μg DNA，終量100 μL，B液：用不含血清培養基稀釋2-50 μg LR，終量100 μL,輕輕混合A. ?B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。 ? (3)轉染準備：用2 mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入1 mL不含血清培養液。 ? (4)轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37 ℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。 ? (5)其余處理如觀察. ?篩選. ?檢測等與其它轉染法相同。 ? 注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。 ? 2. ?快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]： ? (1)以5×105?細胞/孔接種6孔板(或35 mm培養皿)培養24小時，使其達到50～60%板底面積。 ? (2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下： ? ①在1 mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。 ? ②旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。 ? ③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結合在脂質體上。 ? (3)棄去細胞中的舊液，用1 mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1 mL DNA/脂質體復合物，37 ℃培養3～5小時。 ? (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養14～24小時， ? (5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2 mL/孔，再培養24～48小時。 ? (6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。 ? 穩定的脂質體轉染方法如下： ? (1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。 ? (2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2). ?(3)步驟。 ? (3)在每孔中加入1 mL. ?20%FCS的DMEM，37 ℃培養48小時。 ? (4)吸出DMEM，用 g418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞篩選法進行。 ? DEAE-葡聚糖轉染法 ? DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1 g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時)，又可用較低濃度(250 g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。 ? 方法如下： ? (1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5×105?CO2?/孔/皿生長2～3天，當達50%板底面積可用。 ? (2)乙醇沉淀的4 μg的PSV2-neo質粒DNA，空氣干燥后溶于40 μL的TE中，或取供體DNA。 ? (3)用10 mL 1×PBS. ?4 mL. ?10%富合生長因子血清的DMEM洗板(皿)。 ? (4)在80 μl熱的10 g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120 μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中，使其分布均勻輕輕轉動直到顯示均勻一致的紅色，培養4小時。 ? (5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5 mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5 mL 1×PBS洗一次吸出，加入10 mL培養液(10%血清的DMEM)。 ? (6)培養細胞，在適當時間分析細胞，若含有抗藥基因，可用 g418選擇培養液培養，方法同前。 ? 眾所周知，科研工作者在進行醫藥方面的科學研究之前，需要制定完善的統計研究設計方案，那么什么樣的設計方案才稱得上是完善的呢？ 一般來說，完善的設計方案需具備以下幾個條件：實驗所需的人力. ?物力和時間資源；實驗設計的“三要素”和“六原則”均符合專業和統計學要求，對實驗數據的收集. ?整理. ?分析等有一套規范的規定和正確的方法。而其中準確把握統計研究設計的“三要素和六原則”，是科學實驗設計的核心。