1、核酸抽提原理

簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離的過程。 經典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結構的穩定 (如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質變性劑 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。

最常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質純化。第一種方法是利用 PC對裂解體系進行反復抽提以去除蛋白質，實現核酸與蛋白質的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質及鹽的特點，實現核酸與蛋白質及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC操作的麻煩。當然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質 – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現的。

2、了解你的實驗樣品

如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質含量。如果你對樣品的特點一無所知，當樣品稍微有一點復雜時，抽提核酸的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結果。對一些雜質含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質殘留過大的問題，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液最好只保存有核細胞；將樣品分割后保存，避免反復凍融。如果實驗室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。

3、裂解方法的評價

含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質變小，故而對蛋白質的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組 DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA“纏”住，有利于蛋白質在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。

另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優勢，則純化時以 DNA的形式被保留下來，導致蛋白質的殘留；如果蛋白質的特性占優勢，則純化時以蛋白質的形式被去除，導致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質)，原因在于這些樣品中的蛋白質，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，

仍然在細胞基因組 DNA抽提方面有優勢，尤其是當得率和純度要求不是最高，而經濟性及操作簡單很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關鍵。該方法結合高鹽沉淀，可以實現最簡單的操作，但純度及得率的穩定性可能會比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。總 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質的裂解以及基因組與蛋白質“纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質變性劑為基礎的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非常快速簡單，但純度不是很高。

含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關：一是 CTAB的質量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產的純度一樣的CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時， CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵。裂解時的溫度，多使用65C；但如果發現降解嚴重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個相對低溫的區域。 SDS堿裂解法是質粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關鍵。

蛋白質的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時間以及采用 4C 離心去蛋白質，都可以提高質量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結合 PC 純化，可以獲得純度很高的質粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)來實現。總的感覺是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質粒(50 kb 以上)，該方法可能會有問題。 PCR模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。

該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因為不純化，所以，假陰性 (即沒有擴增出來的陽性)比例也比較高。該方法最簡單的裂解液就是水，復雜一點的就會含有一些不會抑制后續的 PCR 反應，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內抑制PCR 反應雜質的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復雜一點的就會含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質的介質。

操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。 選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。

這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴肅的參考資料，都應該會提供一個簡單的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個細胞；我的建議是，你的樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎，會比較合理的。

不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結果 (純度及得率)沒有關系，然而，在實際操作中，對結果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質的過程復雜且不徹底，導致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務必牢記。

4、純化方法

評價 PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩定、可靠、經濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質為蛋白質)，該方法完全可以獲得高質量的核酸。雖然每次 PC抽提都會損失一部分核酸(因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規模抽提。 PC抽提是去除蛋白質的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質變性，變性后的蛋白質從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。

PC抽提的關鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質的充分接觸，使蛋白質完全變性。許多人總是擔心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA變成 10kb 以內的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR和酶切，都是完全適用的。

如果要求的片段非常大，如構建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時的關鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質難以徹底去除，以及基因組 DNA會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質。

PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質之前，是不能使用 PC抽提的，否則核酸必定降解。 高鹽沉淀蛋白質/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點。

更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是，可以用于大規模抽提，不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。蛋白質的沉淀效率在 4C會更好一些。 介質純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩定性很高 (雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。

介質可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質被預先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質的純化操作與經典的醇沉淀差別不大，都是通過數次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質純化方法的成本是最高的。

5、醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現核酸與其它雜質 – 主要是鹽 –的分離。實際操作中，許多雜質也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。 就核酸而言，標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。

實際操作中不難發現，當裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當然，得率可能會降低)。知道這一點的意義在于：不要迷信標準方法的唯一性；相反，當使用標準方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時，完全可以通過調整沉淀條件來改善。

最有參考價值的是 TRIzol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質的沉淀過程；調整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。 如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當核酸濃度很低時，效果明顯；當核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導致雜質的大大增加。

醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發現這二者對質量有大的影響，雖然許多人“發現”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現象，提示結論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。

結合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我幾乎不使用低溫沉淀，難道低溫沉淀比較容易出現鹽沉淀？)；我更覺得出現該現象的原因就在洗滌的不徹底。 當然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內完成。

但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質量決不會有問題的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。

6、洗滌

洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非常可觀，其殘留量多到會影響后續的實驗。唯一不受管子質量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。

一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關。揮發時去掉的是乙醇，雜質是不會被揮發去除的。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數也要考慮增加。最關鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。

7、核酸的溶解和保存

純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程控制得當，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。 基本上，核酸在保存中的穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實驗人員發現，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的穩定，我卻寧可認為這是個例。

如果溫度合適，保存中核酸發生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 (RNA在弱酸性更穩定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發生反應，達到某種均衡。EP管的材質，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導核酸的結構發生某些變化，如變性。

在核酸的濃度比較高時，這個現象可能觀察不到；當核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸，雖然已經為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當回事。 現在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質要好許多，但其化學特征，尤其是對核酸穩定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現在的質粒可以改造得越來越適用某些要求一樣，其負面產物可能是，抽提的質粒電泳的構型越來越多：除了原來的三種帶型外，

8、核酸質量的檢測問題

將抽提好的核酸直接用于后續的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質污染的信息，但是同樣與經驗有關。

紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現壞的結果能用于后續實驗而好的結果卻不能用于后續實驗，也不用大驚小怪。 關于紫外分光光度儀的檢測。

首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始。(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當真。)其次，一定要經常調較儀器；調較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法，非常簡單；具體道理可以見我以前的帖。)最后，要記住讀數 A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1為理論上的數據，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。

有兩個值得商榷的觀點：如果 A260/A230 > 2就是純的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質殘留的(具體是什么雜質我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.3 決不提示核酸降解，原因是：那些能導致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小，常規的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280實際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。

純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280則正好是半山坡。根據曲線在底和頂的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特點，不難得出如下結論：A230 和 A260的讀數受儀器準確性的影響比較小，而 A280 受儀器準確性的影響比較大。 建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考 (降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。