植物抗病基因克隆的研究進展

近年來抗性基因研究的突破性進展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其編碼蛋白的組成、拓撲學和亞細胞定位等特征,為揭開抗性基因的作用特點提供了線索。一般來講,基因克隆的策略可分為兩種:正向遺傳學途徑和反向遺傳學途徑。

前者以欲克隆的基因所表現的功能為基礎,通過鑒定其產物或某種表型的突變進行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表型克隆( Phenotype Cloning) ;后者則著眼于基因本身特定序列或者在基因組中的特定位置進行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。

一、抗病基因克隆的方法

（一）功能克隆

功能克隆即已知基因編碼產物的克隆方法。當目的基因序列未知,但其編碼產物的生理生化及代謝途徑研究得比較清楚時,就可以采用這種克隆方法。

功能克隆根據克隆基因的原理又可分為兩條路線,一條是分離純化已知的蛋白質或多肽,制備該蛋白的特異抗體,利用標記的特異蛋白抗體作為探針篩選由表達型載體建立的基因組文庫或者cDNA文庫,通過免疫雜交篩選到重組克隆,并最終克隆目的基因;第二條路線是將蛋白質純化后測定其N 端一段氨基酸序列,根據蛋白質密碼子編碼規律和密碼子偏愛原則,反向推算出mRNA序列,然后據此人工合成一段寡核苷酸作探針,利用同位素或其它方法標記后篩選一般的基因組文庫或cDNA 文庫,篩選陽性重組克隆,并最終克隆目的基因。

隨著植物抗病反應的深入研究及蛋白質分離純化技術的發展,相信功能克隆的策略會發揮重要作用,但一部分抗病基因的產物及表達調控特性尚不清楚,因此在一定程度上也限制了該策略的應用。

（二） 定位克隆

定位克隆技術是根據目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法,目標基因精確定位在染色體特定位置之后,用目標基因兩側緊密連鎖的標記篩選含有大的插入片段的基因組文庫(如BAC和YAC) ,通過染色體步行篩選到含有目標基因的克隆,最后通過遺傳轉化和功能互補實驗進行驗證。

其核心任務是染色體步行,如果能找到與目標基因很近的標記,以至于二者之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均插入片段大小,就可以直接篩選到含有目標基因的克隆,最終得到候選基因,這種策略稱為染色體登陸。

到目前為止,利用定位克隆策略,單基因性狀相關基因的鑒定方法已較完善且取得了一個系列成果,已使幾十種重要的基因得到了分離。但定位克隆技術需要尋找與目標基因座位連鎖的遺傳標記或部分功能信息。有時需連鎖作圖,較費時費力。而且在植物的基因組中,大量存在DNA 重復序列經常是染色體步移難以逾越的障礙。

（三） 序列克隆

序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列時采用的方法。這種情況下,可以從DNA 序列數據庫(如GenBank 數據庫) 中查找有關基因的序列,然后可以設計并合成一對寡核苷酸引物,提取所要分離基因的植物染色體DNA 或者用RNA 在逆轉錄酶的作用下合成cDNA 的第一條鏈,以此為模板,采取PCR 或RT-PCR 的方法來克隆基因。擴增的片段經純化后,連接到合適的載體上,經酶切和序列分析并與已知的基因序列作比較。

此方法簡便快速,國內利用此方法已經克隆了豌豆外源凝集素基因。有時要從其他的種、屬中克隆同源基因時,可以先比較序列已知的基因序列,尋找比較保守的區域,根據此區域的序列設計并合成探針,然后從cDNA 文庫或者基因組文庫中篩選到目的基因的克隆。

如利用酵母菌乙酰乳酸合成酶的基因序列,已從煙草和擬南芥中克隆出抗除草劑的乙酰乳酸合成酶基因。Payne G. 等根據煙草中酸性幾丁質酶和堿性幾丁質酶的氨基酸序列C 端的同源率為65 % ,以已知的堿性幾丁質酶的核酸序列為探針,從煙草的cDNA 文庫中篩選了兩種酸性幾丁質酶的基因PR-P 和PR-Q。

（四） 表型克隆

表型克隆是與定位克隆相對的一種克隆基因的策略,它是對因突變而導致的某一特殊表型的目的基因直接進行克隆。1995 年Weissman 在前人的工作基礎上首先提出了表型克隆的概念,由于它能較好地解決定位克隆策略所遇到的困難,因此被稱作是分子遺傳學觀念上的一次革新。

它可對因突變而導致的某一特殊表型的目的基因直接進行克隆分析并分離該基因,而不必事先知道其生化功能及在染色體上的精確位置,也不需知道假設基因的數目或其作用方式,將表型與基因結構或基因表達的特征聯系起來從而分離特定表型相關基因。表型克隆與定位克隆相比,省去了用大量遺傳標記進行定位分析的繁瑣程序,可較容易地檢測基因組之間差異或相同區域,大大加快基因克隆的速度。

二、應用較多的幾項技術

（一）鳥槍克隆法（Shotgun Cloning）

該方法是隨機切割供體基因組DNA ,再轉化到受體基因組中,根據對轉化子的表型鑒定,然后找出所需克隆的基因,鳥槍克隆戰略成功地應用于分離細菌的無毒基因。Staskawica B. J . 等利用這一策略,從大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的無毒基因。

但是在高等植物中,由于基因組很大,因而應用這種方法克隆基因非常困難。例如,如果將此方法應用于番茄的抗病基因篩選,需要以雙元載體構建抗病品種的基因文庫,然后通過農桿菌等將它們導入感病品種之中,然后篩選抗病轉化體來分離抗病基因。但這樣鑒定一個單拷貝的基因,需要篩選105株轉基因植株,工作量非常大。

(二) 消減雜交法（Subtractive Hybridization）

消減雜交法是利用DNA復性動力學來富集一個樣品中有，而另一個樣品沒有的DNA。消減雜交可以是cDNA 。用來尋找兩樣品中差異的基因，也可以是基因組DNA，用于樣品中特異存在的基因。其方法是將過量的driver DNA和樣品中的目的DNA退火，然后復性，樣品中的共同序列形成雙鏈，而目的DNA序列大多數為單鏈。用羥基磷灰石柱或者生物素標記結合等方法不斷除去雙鏈DNA序列。經過多輪變性和復性，樣品中的特異性目的DNA序列得以富集，或者用PCR進行體外擴增。通過遺傳學分析驗證富集的克隆DNA。負性雜交法比其他基因克隆法省時省力。但目前還不能用于復雜的基因組植物的抗病基因克隆。

（三）轉座子標簽法（Transposon Tagging）

就植物抗性基因的克隆工作來講,轉座子標簽技術( Transposon Tagging) 可能是應用最為普遍的一種方法。它是利用轉座子來克隆基因的技術,其顯著特點是可以分離預先不清楚表達產物的基因。其基本原理是:當轉座子插入到植物基因組中某個基因或者基因的鄰近位點時,會破壞該基因的結構,引起基因突變使植物表型發生變異,因此可以用轉座子作為探針從被標記的突變體植物的基因文庫中,克隆出突變的基因,然后再利用突變基因作為探針從野生型植物中克隆出野生型基因。

（四）圖位克隆法(Map - based cloning)

圖位克隆法是根據目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法,在目標基因精確定位到染色體的特定位置以后,運用與目標基因緊密連鎖的分子標記篩選含有目標基因的大片段基因組文庫(BAC或YAC) ,再通過染色體步行篩選到含有目標基因的亞克隆,最后通過遺傳轉化和功能互補實驗進行驗證。

圖位克隆法是以高密度的分子標記圖譜為基礎,其關鍵是尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記,核心任務是染色體步行。但是對于基因組較大,重復序列較多的一些植物,采用該方法分離克隆抗病基因不僅投資大而且效率低,因此,該方法也受到一定的限制。

除了上面介紹的幾種技術，在植物抗病基因克隆工作上還會用到的有: DNA 轉染法(DNA Transfection) 、代表性差異分析技術(Representational Difference Analysis) 、mRNA 差異顯示(mRNA Differential Display) 、抑制消減雜交法(Suppression Subt ractive Hybridization)、產物導向法、插入誘變法、作圖克隆法等。