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相互作用在生理上的證實和探索

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l????? 通過免疫共沉淀確定結合蛋白

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1． 用磷酸鹽緩沖液洗 30 塊 10 cm 培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解緩沖液中。

2． 將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上 4 ℃以最大速度離心 15 min 。

3． 收集上清（約 30 ml ）并加入 30 μ g 的適當抗體， 4 ℃搖動免疫沉淀物 1 h 。

4． 加入 0.9 ml 的蛋白質 A-Sepharose 懸液， 4 ℃搖動免疫沉淀物 30 min 。

5． 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重復洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。

6． 吸出混合物的液體部分。加入 800 μ l 的 1 × SDS 膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸 4 min 。

7． 將樣品加入到大孔的不連續 SDS-PAGE 梯度膠中，在 10 mA 的恒定電流下電泳過夜。

8． 通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。

9． 從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用 1ml 50% 乙腈洗兩次，每次 3 min 。

10．? 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫。

11．? 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在 ABI 477A 或 494A 機器上進行自動 Edman 降解測序。

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