一、核酸的純化

在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的純化。其關鍵步驟是去蛋白質，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。

每當需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進行下一步時，可進行這種抽提。然而，如要從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后，再用有機溶劑抽提。

這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對多種天然蛋白均有活性，

（1）用酚氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用，比單獨用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。

①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿。

②旋渦混勻管內容物，使呈乳狀。

③12000×g室溫離心15秒。

④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相。

⑤重復步驟①－④步操作，直至兩相界面上見不到蛋白質為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。

二、核酸的濃縮

應用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當的緩沖液中。

具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15－30min，取出目測平衡，0－4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當體積的緩沖液中。

單價陽離子鹽溶液

*：當加醋酸銨時，需加入DNA液的V/2。

單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。

三、DNA、RNA的定量

準確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的（即無顯著的蛋白質、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收，然后，按IA260相當于50μg/ml雙鏈DNA。

40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計算你的樣品含量。260nm和280nm兩處讀數的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時就無法對樣品中的核酸進行精確定量。

可將樣品純化后再作定量測定。有豐富實驗室經驗的人，僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強度，即可大致判斷出樣品中的核酸含量，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝膠電泳和分子量參照物

（一）瓊脂糖凝膠電泳

可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡單、迅速，能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物，分開的DNA可用低濃度的螢光染料（0.5μg/ml溴化乙錠）染色，在紫外燈下直接觀察檢測少至1ng的DNA。

DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數：

①DNA分子的大小：線獎雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數成反比。據此用已知分子量的標準物質和待測分子量的DNA片段同時電泳，比較其電泳速率，即可求出待測片段的分子大小。

②瓊脂糖濃度：給定大小的DNA片段，以不同速度通過不同濃度的瓊脂擴凝膠。因此利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛，大小不同的DNA片段

不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

③DNA構型：相同分子量的閉環（Ⅰ型），開環（Ⅱ型）和線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠，一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④應用的電壓：在低電壓時，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是壓增高時，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的，因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力，凝膠電泳時電壓不應超過5V/cm