引物設計常見問題與解答(二)

1. 長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%,產生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。

但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

2. 如果測序發現突變，該如何處理？

答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們取得聯系，我們的生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數據。如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。

根據我們經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。

您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。

3. 如果測序發現引物突變，是否有補償？

答：沒有。我們可以免費重合一次，沒有其他任何補償或賠償，不承擔其他連帶責任。原因我們在前面已提到，化學合成效率不可能達到100%.您選擇了化學合成引物，合成過程中一些副產品所帶來的后果就可能不可避免的遇到。

4. 引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。

國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

5. 為什么OPC或PAGE純化的引物，再用HPLC鑒定純度不高？

答： 有些用戶引物需要純度特別高的引物，在使用前會將HPLC鑒定引物的純度，常常發現引物的純度一般在70%左右。問題來了，還有那30%是什么？ 引物純化PAGE, 需要電泳，用緩沖液將引物浸泡出來，然后用C18濃縮，乙醇沉淀。

沉淀得到的核酸物質基本引物了，除此以外，還有其他一些非核酸類物質，他們一般不會干擾引物的使用。OPC純化也類似的情況。即使是HPLC純化的引物，如果對成品進行分析，一般也難達到很高的純度，引物您得到的純品都是由制備柱過來，洗脫峰經過濃縮抽干，部分非核酸物質被富集。

6. 為什么修飾引物的產量要比一般引物低，價格要高？

答：主要因為是修飾單體穩定性較差，偶連時間長，效率低，最后得到的產量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產品的價格自然高。