RNA探針是一段單鏈cDNA分子，本文總結了RNA探針的分類、制備方法、探針的純化、雜交前的注意事項，RAN探針效價的測定以及探針的選擇。

RNA 原位雜交中的探針

（一）探針的種類

RNA 探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈 cDNA 或 cRNA 分子。 根據在 RNA 雜交中所使用的探針依其來源可分為三種： 即特異性 cDNA、 cRNA 探針和人工合成寡核苷酸探針。

1. 單鏈 cDNA 探針： 由于 cDNA 中不存在內含子及其它高度重復序列，又克服了雙鏈 cDNA 探針在雜交反應中 兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性。但由于單鏈 cDNA 探針的制備比 較困難，在 RNA 原位雜交中已很少見有應用。

2. cRNA 探針： 是以 cDNA 為模板，通過體外轉錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了應用 雙鏈 cDNA 探針做雜交反應時存在的兩條鏈之間的復性問題。cRNA 與 RNA 之間形成的雜 交體要比 cDNA-RNA 雜交體穩定。

cRNA-RNA 之間形成的雜交體不受 RNA 酶的影響。因 此雜交反應后可用 RNA 酶處理， 以除去未結合的探針。 由于 cRNA 探針具有以上這些優點， cRNA 探針的雜交飽和水平又比雙鏈 DNA 探針高出 8 倍， 因此在原位雜交中應用廣泛。 cRNA 探針的缺點是：探針的制備過程比較復雜，需要較好的分子生物學實驗設備，它對 RNA 酶 敏，易受破壞，操作中要謹防 RNA 酶污染。

3. 寡核苷酸探針： 人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過 DNA 合成儀合成，避免了真核細胞中存在 的高度重復序列帶來的不利影響。由于大多數寡核苷酸序列較短，不需要純化，組織穿透性 極好。 根椐目的基因的特異性序列設計的探針， 特異性較強。

合成的寡核苷酸探針的缺點是： 探針長度必須適宜，探針太長可造成內部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結合。它 與 mRNA 形成的雜交體不如 cRNA-RNA 雜交體穩定，再則探針較短，所攜帶的標記物少， 敏感性較低。 依標記物不同，探針又可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。

前者主要包括 3H、35C、32P 和 125I 等，不同的同位素探針其穿透力、定位和半衰期各不相同，無一種同 位素探針具有穿透力強、定位好和半衰期長所有優點。

由于半衰斯短、性能不穩定、污染環 境和危害健康等原因，在 RNA 原位雜交中應用同位素標記探針已日趨減少，而非同位素標 記探針在近年來得到迅速發展，其標記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標記等。

其中地 高辛標記的 cDNA、RNA 和寡核苷酸探針，不但具有生物素標記優點，還克服了生物素標 記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干擾等缺點，其應用越來越廣泛。

（二）探針的標記

在 RNA 原位雜交中，不僅要選擇適當的探針，而且還要使探針得到有效的標記。探針標記 法有酶反應法和化學反應法。

1. 酶反應法： 用于 RNA 探針的酶反應法主要為末端標記法與體外轉錄法。末端標記法是將標記物導入線 型 DNA 或 RNA 的 5'端或 3'端的一種標記法，末端標記適用于合成寡核苷酸探針的標記， 用末端標記制備的探針一般攜帶的標記分子較少。

2. 體外轉錄法： 體外轉錄法是一種制備與片段序列相同的單鏈 RNA 探針的方法。 進行體外轉錄時，先將靶核苷酸序列轉入到含噬菌體轉錄啟動子的載體中，然后在 RNA 聚 合酶的作用下，以 DNA 為模板，以含有標記的三磷酸苷為原料，對啟動子下游的序列進行 轉錄，而啟動子本身并不被轉錄。

體外轉錄常用噬菌體轉錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體 T3、T7。當兩個不 同的噬菌體轉錄啟動子結合在載體多位點的兩側， 用適當的限制性內切酶在插入序列的下游 將質粒線性化。

SP6 噬菌體的 RNA 聚合酶對 SP6 啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動 下游的轉錄，在 4 種三磷酸核糖核苷和相應的噬菌體 RNA 聚合酶存在的條件下，即轉錄成 RNA。如反應物中含有標記的三磷酸核糖苷核，所有的 RNA 就被標記。 依標記物為同位素和非同位素， 近年來非同位素標記探針已有了極大的進步。 常用非同位素 標記技術有生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。

非同位素標記法又可分為直接標記法和間接標記法。 直接標記法是將標記物直接結合到探針上， 當探針與組織內相應靶核苷酸結合后， 即可顯色 觀察。這類標記探針必須符合標記物在雜交過程中不丟失，又不影響雜交反應為條件。

大量已發表的文獻表明，由于檢出雜交信號受到多種因素抑制，只能限于靶 RNA 豐富的細胞或 組織中，RNA 雜交對低拷貝的基因檢測不理想。近年來間接標記法得到較快發展，先將標 記物結合在探針上，通過特異性識別，由特異性結合多種酶，對檢測的雜交信號作用放大， 這一類標記法已展示極好的發展前景。

（三）探針的純化

某些標記探針必須經純化后方可使用。 這是因為在探針標記過程中， 反應液中仍存在一些未 被結合到探針中去的剩余 dNTP 等小分子。為將摻入并結合到 cDNA、cRNA 和標記寡核苷 酸與游離的標記寡核苷酸分開，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進行純化。

乙醇沉淀法的原理是：DNA 可被乙醇沉淀，而未摻入 DNA 的 dNTP 則保留在上清液中，由 此反復乙醇沉淀能將兩者分開。

核酸溶液中去除蛋白質的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質 變性劑，以增加去除蛋白質雜質的效果。因為酚雖能有效地變性蛋白質，但不能完全抑制 RNA 酶的活性，而且酚能溶解 10~15% 的水，從而溶解一部分 ploy（A）RNA。

為克服這兩方面的局限，混合使用酚與氯仿，對于 RNA 提取顯得更加重要，氯仿還能加速有機相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。

（四）雜交前準備

1. 載玻片和蓋玻片的處理 為有效防止外源性 RNA 酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理。

將載玻片和蓋玻片分別浸泡在 5% 潔消精中 12 小時，用 35℃~40℃ 溫水中沖洗 30min，再用雙蒸水漂洗 3 次，每次 5min，室溫下干燥切片后，在 180℃ 烤箱內烘烤 4~6 小時，蓋玻 片可按近期內所需量，用鋁箔紙包裹后烘烤后存放。 為防止組織或細胞標本在雜交過程中漂起或脫落， 載玻片應涂以粘附劑， 大的冰凍或石蠟切 片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。

2. 明膠涂片制備 取 10 克明膠溶于 1000 毫升 40℃~50℃ 雙蒸水中， 待明膠完全溶解后加入 4 毫升 25% 硫酸 鉻鉀溶液（chromium potassium sulfate CPS） ，使 CPS 的終濃度為 0.1%。將烘烤后的載玻片 浸泡在明膠溶液中 10min， 在室溫下干燥玻片。

再將載玻片浸泡在含有 1% 多聚甲醛， pH7.4 的 PBS 溶液中 10min;在室溫下干燥玻片后再將載玻片浸泡在含有 1% 多聚甲醛，pH7.4 的 PBS 中 10min，在室溫下干燥玻片。60℃ 烤箱內過夜備用。

3. 多聚左旋賴氨酸涂片的制備 取 2~4mg 多聚左旋賴氨酸，分子量在 300000 以上，溶于 1ml 消毒去離子水中。經旋渦器反 復攪拌，吸取 20~30μl 滴加到玻片一側，再取另一張載玻片復合，將賴氨酸溶液均勻涂抹在 裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉛筆標出，室溫下干燥切片后，在 60℃烤箱內過 夜備用。

4. 硅烷涂片的制備 取 5 毫升氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane APES）溶于 250ml 丙酮內。將 烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中 60min，用雙蒸水漂洗 2 次，每次 10min 干燥玻片后，60℃ 烤箱內過夜備用。

注意事項： 載玻片的粘附劑及涂片制備，以組織切片或細胞不脫落、不干擾雜交信號、低背景、經濟及 制備方便為原則，在制備過程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮膚上的 RNA 酶的污 染。多聚左旋賴氨酸溶液的濃度可按實際應用效果調整，并應注意有效期限，制備載玻片應 盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效。

5. 新鮮標本的儲存和冰凍切片制備 為 RNA 原位雜交作新鮮標本儲存和冰凍切片過程中，應嚴防 RNA 酶的污染，制備過程中 所使用的容器、刀具等均經高壓消毒或清潔后用 0.1% 焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate DEPC）水清洗。

為防止 RNA 迅速降解，標本離體后，先切成 1.5× 1.2cm 大小，其厚度不超過 0.2cm，應迅 速投入 4% 多聚甲醛溶液內， 4℃冰箱內 2~4 小時。 置 再將組織移入 30% 蔗糖 PBS 溶液內， 4℃ 冰箱內過夜。次日可將標本儲存于-80℃ 或-140℃ 超低溫冰箱內保存。

如作冰凍切片，先將組織在-20℃恒冷切片機內停留，待溫度回升后，然后在恒冷冰凍切片 機內切成 7μm 薄片。 40℃ 烤箱內干燥切片 2 小時后儲存在-80℃ 或-140℃ 超低溫冰箱內備 用。

6.標本的固定和石蠟切片的制備 石蠟切片作 RNA 原位雜交的，也應嚴防 RNA 酶的污染，容器、刀具等去除 RNA 酶的過程 同冰凍切片。

為防止 RNA 迅速降解，離體后標本應立即有效固定。

為保存良好組織結構， 有利探針的穿透力，應選用合適的固定劑。 常用的化學固定劑可分為沉淀固定劑和交聯固定劑兩類。前者有乙醇、甲醇和丙酮等，后者 有多聚甲醛、甲醛和戊二醛等。經沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入，但過 長時間固定可引起 RNA 降解。

其不足之處是：組織形態結構的保持不如交聯固定劑。交聯 固定劑能較好保存組織中 RNA 和組織形態結構，但固定時間過長，也可發生胞漿和胞核內 大分子化合物形成交聯，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。

4%多聚甲醛固定液 取 4g 多聚甲醛和 0.25g 甘氨酸分別溶于 100ml 0.01mol/L pH7.0 PBS 溶液，組織在常溫下浸 泡于 4% 多聚甲醛中 4 小時，每 1 小時將組織在真空下吸干 10min，再注入新的固定液，共 4 次。

然后用 0.01mol/L pH7.0 的 PBS 漂洗 2 次，每次 30min。

福爾馬林醋酸固定液 福爾馬林醋酸固定液由 50% 酒精、10% 福爾馬林和 5% 醋酸組成。在常溫下將組織浸泡 4 小時，每 1 小時在真空下吸干 10 分鐘，再注入新的固定液，共 4 次，然后用 50% 酒精漂 洗 2 次，每次 30min。

（五）雜交前探針的選擇

1. RNA 探針： RNA 探針的長度以 50~150 堿基為佳，探針易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。長 500 個 堿基的探針雜交時間約需 20 個小時左右，如超過 500 個堿基的 RNA 探針則在雜交前用有 限堿基水解法控制其長度。

（1）孵育時間 t=Lf- Lo/ K × Lo× （Lo=核酸探針原長度（kb），Lf=核酸探針水解后所需長度 Lf （kb），K 是常數率=0.11kb/min）。

（2）在室溫中加入下列終止水解：3mol/L 醋酸鈉，6.6μl（終濃度 0.1mol/L），醋酸 1.3μl（終濃度 為 0.5%）。

（3）加入下列沉淀探針： 7mol/L 醋酸銨 100μl， 100%乙醇 750μl， RNA （10mg /ml） 2μl， 置-20℃ 2 小時后恢復到室溫，在 1400rpm 離心 30min。

（4）小心將乙醇倒出，待試管內干燥后再用無菌 ddH2O 稀釋到 10ng/μl 濃度。

（5）最終探針長度可于 10% 聚丙稀酰胺凝膠在 60℃ 的尿素中電泳檢測。

2. 探針的長度 原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度， 探針濃度必須給予該實驗最大信噪比， 因為 背景著色度高低與探針濃度有關。

最佳探針濃度是最低探針濃度達到靶核酸的最大飽和結合 度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標記 cRNA 探針的濃度為 0.5ng/μl，而非 放射性標記 cRNA 探針的濃度 1.0ng/μl。雜交液的量要適當，每張切片以 30~50μl 為宜。 保持雜交液不流失的關鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應用雜交罩等也很必要。

3.雜交的溫度和時間 設置和調整雜交溫度是 RNA 原位雜交的重要環節。

雜交溫度應低于解鏈或融解溫度（melting temperature Tm）20-30℃。 多數 RNA 原位雜交 Tm 為 95℃， 由于這一溫度對保存組織形態完整和組織切片的粘附將產 生不利影響， 為此在雜交液中常以增加甲酰胺濃度來降低 Tm 值， 因為每增加 1% 甲酰胺濃 度可降低 0.72℃。

另外雜交體中 GC 的百分比、雜交體長度以及雜交液中 Na+的濃度也與 Tm 呈正相關。 雜交反應的時間可隨探針濃度的增加而縮短， 雜交時間過短會造成雜交不完全， 雜交時間過 長會增加非特異性著色。一般 RNA 原位雜交采用雜交孵育過夜，在黑暗環境下進行，可以 避免光線對甲酰 RNA 探針的制備 樣本 DNA 的性質

1、 純度：高純度質粒提取試劑盒提取并純化

2、 大小：100bp-10kb，大于 10kb 需要限制性內切酶的酶切

3、 含量：1ug 質粒 DNA→10ug 標記 RNA 樣品制備

4、 在克隆插入位點下游，使用限制性內切酶將質粒線性化

5、 為了避免不需要序列的轉錄，使用限制性內切酶對 5‘段進行修飾

6、 酶切后，使用高純化的 PCR 產物純化試劑盒純化或 工作液的準備 溶液 準備 儲存 用途 水：PCR 級或 雙蒸水中加入 0.1% 15-25℃ 調整溶液體積或 DMPC 處理水 methylpyrocarbonate resuspend RNA EDTA 0.2M ethylene-diamino- 15-25℃ 終止反應 Tetraacetic acid， pH 8.0 步驟標準 RNA 標記反應：

1、1ug 純化的模版 DNA 或 4ul 對照 DNA 進行消毒，加足夠的水至 13ul 體系

2、將反應物均放在冰上，然后加入下列試劑： 10×NTP labeling mixture 2ul 10×Transcription buffer 2ul Protector RNase inhibitor 1ul RNA Polymerase SP6 or 2ul RNA Polymerase T7 輕輕混勻并瞬時離心，37℃孵育 2h。

（長時間的孵育并不能增加標記 RNA） 3、加 2ul DNase I，除去模版 DNA;37℃孵育 15min（試劑盒可不做此步驟） 4、加 2ul 0.2M EDTA（pH8.0）終止反應。