一 酶切和電泳

在200 μl 微量離心管中加入：

25 μl DNA樣品約10μg)，

3μl 限制性內切酶（MBI，10 U/ μl）

5 μl 相應的10×buffer，

補水到50μl。

然后加一滴礦物油覆蓋, 稍微離心后放于37℃水浴8-12小時。酶切完后，取5μl 酶切DNA樣品于0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose膠，加入上樣buffer后，在25—30V穩壓電泳12—16hrs。

注意：在southern雜交中對，DNA的質量要求較高，否則酶切不完全導致失敗。

二 轉膜

1 用0.2MHCl 脫嘌呤處理，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍完全變成黃色，大約需要15~30分鐘。然后用水漂洗凝膠2~3次，將水倒盡，加入堿變性液，偶爾輕輕振蕩至溴酚藍完全恢復到原來的藍色（大約需要20~30分鐘）。

注意：此方法對酶切后目標片段大于15kb時用，如果小于15kb最好不要進行脫嘌呤處理，否則容易將片段打斷，導致轉膜后結合不緊密。

2 取一磁盤架上一洗凈玻璃板，在磁盤中倒入適量的轉膜緩沖液，在玻璃板上架兩層長濾紙（30cm左右）（注意不要產生氣泡）搭成鹽橋。（濾紙比膠弱寬）依膠大小裁好尼龍膜，寫好標記，正面向下，緊貼于膠上，防止有氣泡產生，接這壓兩張同樣大小的濾紙，不可過大以免短路，膠周圍用X光片壓條。膠應反面朝上因為DNA多在膠的底層。堆積吸水紙。上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。

注意：防止短路

3 轉膜16---20hrs后，將尼龍膜取下，膠染色，觀察轉膜效果。將膜用2xSSC浸泡20分鐘，濾紙吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。待用。

三 雜交

雜交爐與雜交管預熱至65℃

尼龍膜用2×SSC浸泡

配置雜交液

ssDNA沸水變性10min，冰浴10min，置冰浴備用

Components Volume (ml) Note

ddH2 O 20.7

50×Denhardts 0.6

P/H stock 8.1

20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)

Total 30 ml for 2 blots. 65℃預熱.

Add prepared ssDNA （10mg/L） ≥0.3 ml

倒入雜交液，加入尼龍膜，65℃預雜交4~5小時（新膜）

注意：趕盡膜與膜之間的氣泡后把幾張膜同時放入雜交管，并用玻棒趕盡膜與管壁之間的氣泡，最后加入雜交液，蓋好管蓋。

四 探針標記

（for1~2 blots）

ddH2 O 7 ml

Marker 1.5 ml

模板DNA 2 ml (about 100 ng)

沸水變性8min，冰浴10min，瞬時離心

Add Buffer Primer 7.5 ml

Add dNTPs(-dCTP) 3 ml

Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)

瞬時離心

Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)

37℃ 水浴≥4小時

五 雜交

向標記探針的離心管中

Add 等體積TE 25 ml

Add 10×體積變性劑（雜交液） 250 ml

沸水變性10min，冰浴10min，將變性好的探針加入到雜交液中，混勻，65℃雜交過夜（12~16小時）。

六 洗膜

1. 2×SSC,0.5%SDS 5min

2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)

3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)

(洗膜過程中不斷檢測放射性強度直至200~500)

濾紙吸干洗液，保鮮膜包好，暗室中壓片，根據放射性強度暴光若干天。

沖洗X光片。

說明：

由于做southern的整個過程比較復雜涉及到的試劑也比較多，我這里僅做了個簡要的敘述，但基本的實驗過程已列舉出來了，此過程中的試劑可以根據具體的實驗要求適當調整，如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具體的介紹，請與我聯系，我們共同討論學習，另外，做雜交的過程中一定要注意防止同位素泄漏，做好個人的防護工作。