原核表達--宿主體系選擇指南

蛋白表達技術全攻略

在原核蛋白表達過程中,選擇構建一個合適原核表達體系需要綜合考慮3大因素：表達載體 、宿主菌株、表達誘導條件,以獲得最滿意的表達效果.事實上,在平時的實驗中,最容易被忽視的就是宿主菌的選擇――多數人會直接選擇自己實驗室曾經用過的表達菌株,或者是載體配套的菌株,而不去追究原因――即使表達結果不佳,大多在表達條件和載體上找原因,也不會考究菌株的選擇是否適合.

作為原核表達的宿主,對外源基因的表達會產生一定的影響,是勿庸置疑的.每一個宿主細胞都像一個微觀的小工廠,按照細胞固有的程序完成“你給它們安排的生產任務”――因為很難親眼觀察微觀世界中表達是如何進行的,當出現問題時,我們需要經驗判斷問題所在.宿主細胞對原核表達可能會產生哪些影響呢?

知其然還要知其所以然.比如,菌株內源的蛋白酶過多,可能會造成外源表達產物的不穩定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株.堪稱經典的BL21 系列 就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型,也是我們非常熟悉的表達菌株.大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因,為T7表達系統而設計.

真核細胞偏愛的密碼子和原核系統有不同,因此,在用原核系統表達真核基因的時候,真核基因中的一些密碼子對于原核細胞來說可能是稀有密碼子,從而導致表達效率和表達水平很低.改造基因是比較麻煩的做法,Rosetta 2 系列就是更好的選擇―― 這種攜帶pRARE2質粒 的 BL21衍生菌,補充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG)稀有密碼子對應的 tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統中的表達水平.(已經攜帶有氯霉素抗性質粒)

當要表達的蛋白質需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時,可以選擇K-12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB)和glutathione reductase (gor)兩條主要還原途徑雙突變 菌株,顯著提高細胞質中二硫鍵形成幾率,促進蛋白可溶性及活性表達.(卡那霉素敏感)

Rosetta-gami? 2 則是綜合上述兩類菌株的優點,既補充7種稀有密碼子,又能夠促進二硫鍵的形成,幫助表達需要借助二硫鍵形成正確折疊構象的真核蛋白.(卡那霉素敏感)

Origami B 是衍生自 lacZY突變 的 BL21菌株,這個突變能根據IPTG的濃度精確調節表達產物,使得表達產物量呈現IPTG濃度依賴性.(四環素敏感)

在決定試用這些名字古怪的菌株時,有幾個小TiPS 要注意的,一個是不同菌株有時已經攜帶某個質粒或者已經具有某種抗生素抗性,要注意自己的表達質粒是否能與之兼容.比如Rosetta 2 已經攜帶有氯霉素抗性質粒,不能再用氯霉素篩選等等.

重組質粒和菌株的保存建議

在實驗室里保存重組菌株的時候,為了挑菌和傳代方便,我們常用LB平板保存在4℃冰箱中,需要提質粒和表達接種的時候,就直接從平板上挑菌,但是這種方法對于重組質粒的穩定性不利,容易出現質粒丟失、表達水平不穩定、菌株退化乃至發生污染等情況.我們建議：

1、長期存放菌株和pET重組子應該存在甘油-70℃保種.但是要注意高濃度甘油(> 10%)會導致質粒不穩定.請盡量保持甘油濃度8%.(15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行)

2、重組質粒不宜長期保存于表達菌株(帶DE3的大腸桿菌)中,請盡量使用帶有recA endA突變的克隆菌株(比如C600,DH5a)進行質粒抽提和保存質粒.表達型的菌株提質粒經常會有質量不高或者背景的問題.特別是大量抽提.

其實不僅僅是表達,建庫克隆都會涉及菌株的不同要求,推薦看看以下文章：克隆/建庫專用超級高效感受態細胞 .感受態不是目的,菌株的背景才是關鍵.