蛋白表達技術全攻略

通過大腸桿菌表達目的基因大量獲得重組蛋白是一個方便快捷的方法.植物中克隆的目的基因被克隆到特異設計的質粒載體上,受噬菌體T7強啟動子控制;表達由宿主細胞提供的T7 RNA聚合酶誘導.當需要表達蛋白時,在細菌 培養基中加入IPTG來啟動表達.不同載體在鄰近克隆位點處具有編碼不同的多肽“標簽”的序列,在定位、檢測或純化目的蛋白時提供方便.

以pET-32a(+)為例,介紹將目的基因克隆 進載體并進行表達獲得重組蛋白的過程,從而熟悉根據自己的要求采用不同的載體進行原核表達的全過程.

1.準備工作(試劑配置和器材準備)

1)操作流程示意圖

主要步驟操作

①制備pET-32a(+)載體 用限制性酶消化,去磷酸化后膠純化回收

②制備插入DNA PCR 裝入質粒后進行限制性消化,再回收

③插入片段克隆到pET-32a(+)載體 插入片段與pET連接,轉化

④轉化表達宿主菌BL21 轉化帶有T7RNA聚合酶基因的菌株

⑤誘導表達目的蛋白 SDS-PAGE,Western 印跡、定量分析確定目的蛋白

⑥放大試驗純化目的蛋白 放大試驗,制備粗提物,親和純化,切除融合標簽

2)配制生長培養基如LB,和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存儲液.

3)宿主菌的保存.長期存放菌株和pET重組子應保存于甘油中.

4)感受態細胞的制備,參照其它試驗手冊.

2.操作步驟

[1] 制備載體

1)載體消化和膠純化

3μg pET載體

3μl 10×限制性內切酶buffer

10-20U 兩種酶(是否共用buffer; 酶體積不要超過反應體系的10%)

3μl 1mg/ml乙酰BSA(根據需要

補足水到30μl

2)37℃溫浴2-4h

3)取3μl樣品進行電泳檢測消化反應進行的程度

4)消化完全后,加入0.05U小牛堿性磷酸酶,37℃ 30min

5)全部樣品在1%瓊脂糖膠上電泳,切帶按照膠回收試劑盒說明回收目標片段.

6)-20℃保存備用.

[2]制備插入片段

限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規方法.一般先用PCR擴增帶酶切位點的目標基因,克隆進T-載體,然后用與消化載體相同的內切酶進行消化和膠回收.但在PCR過程中,需要減少突變的發生,可采用高保真酶,盡量減少PCR循環次數,增加模板和引物的濃度.

[3]在pET32a載體中插入片段

連接反應

2μl 10×連接buffer

2-5μl 50ng/μl 預制的pET32a載體

1μl T4連接酶

5-7μl 預制目標基因插入片段

加水到20μl,槍頭混勻,16℃反應2h-過夜

[4]轉化

轉化方法同T-載體轉化大腸桿菌DH5α一樣,既可轉化BL21也可轉化DH5α,若轉化DH5α,需要重新抽提質粒,再轉化BL21.篩選LB平板需含50μg/μl 卡那霉素.

[5]pET重組子鑒定

如果亞克隆成功,陽性菌落數遠大于陰性菌落.檢驗轉化子的方法很多,包括PCR、質粒抽提及酶切分析、測序,體外轉錄和翻譯.

[6]DE3溶原菌的誘導表達

(1)、從新鮮的劃線平板中挑取單克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液體培養基中,37℃培養至OD600為0.4-1.

(2)、培養基中加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM(T7啟動子)或1 mM(T7lac啟動子),繼續培養2-3小時.

(3)、將搖瓶置于冰上5min,5000g 4℃離心5min收集菌體.

(4)、重懸細胞于0.25倍體積預冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中,離心.

(5)、除去上清,菌體保存于-70℃或繼續純化.

[7]SDS-PAGE進行目標蛋白質分析

(1)、機械破碎細胞.一般用弗氏壓碎法或超聲波處理.

(2)、裂解液14000g離心10min,分離可溶和不溶部分.

(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上樣buffer和水.85℃迅速加熱3min使蛋白變性,然后上樣進行SDS-PAGE分析,觀察蛋白表達.

(4)若目標蛋白在不溶部分中,需進行包涵體純化.750μl20mMTris-HCl,pH7.5重懸沉淀,離心10000g5min,除去上清重復洗滌.然后1.5ml 1%SDS上樣buffer中重懸沉淀,重復(3)的步驟進行SDS-PAGE分析.

3.總結(注意事項)

(1)所有操作盡量在冰上操作,以避免蛋白質發生變性;

(2)根據自己的需要選擇不同的表達載體,并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因,其中有些標簽是可以去除的.

(3)構建好的載體最好進行測序驗證,保證讀碼框正確,即沒有移碼.

(4)長期保存的pET重組子在高濃度甘油(19%)中會導致質粒不穩定.

(5)T7lac啟動子是嚴謹啟動子,IPTG誘導時可以優化最佳濃度(25uM-1mM之間)使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性.

(6)37℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體,而30℃生長則可能產生可溶的和有活性的蛋白.在某些情況下,低溫(15-20℃)延長誘導時間(過夜)可以使溶解性蛋白的產量達到最大.

(7)進行SDS-PAGE分析時,需優化電泳上樣體積.