蛋白表達技術全攻略

甲醇酵母表達系統有不少優點，其中以Invitrogen 公司的Pichia酵母表達系統最為人熟知，并廣泛應用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學(Georgetown University)Lombardi癌癥中心(Lombardi Cancer Center)，部分用戶來自國內。

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EasySelect Pichia Expression System

產品性能：

優點――使用簡單，表達量高，His-tag便于純化

缺點――酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題

全面產品報告及心得體會：

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種能高效表達重組 蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達載體 pPICZ在多克隆位點(MCR)3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor(α-factor)用以增加表達，并且在表達后α-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇――甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。

第一步 ―― 構建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆 位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關是選擇pPIC9K還是pPICZ系列?pPIC9K屬于穿梭質粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用 抗Zeocin篩選(PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝)，而且對于大小合適(30―50KD)的蛋白在產量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了(橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛)，她和大腸桿菌長得有較大區別(大腸桿菌是桿狀的)，因此在培養的過程中要區別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌(我們實驗室曾經污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經歷)，如果在不知情的情況下繼續做下去，那可以就是浪費大把的時間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好(多糖偏酸環境)，生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達(其實后來發現大腸桿菌pET系列分泌表達系列也不錯)和糖基化修飾(主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾)。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點不能出現在目的DNA片段中――如果片段長無法避免，可以采用平末端連接;

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設計表達的時候，如果在N端不能出現任何多余的aa(比如藥物蛋白表達)，需要特別留意(說明書上有詳細說明：P13);

③有三種不同的讀碼框(對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列)，在設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題;

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA(終止密碼子)，但是pPICZ系列沒有ATG(起始密碼子)，有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利;

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子;

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的;

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的(其它像是DH5α都行)，但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養基要用低鹽培養基(NaCl減半)，這主要是因為怕影響到抗生素作用(Zeocin平板要避光保存);

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物;

⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯基因片段進行表達，另外也可以在轉化酵母的時候重復轉化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列(x=任何氨基酸)，因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉錄，也需要多加注意。

第二步 就是將線性化的DNA轉化入Pichia酵母中。

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉儀(electroporator)，可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準備了化學轉化試劑――EasyComp Transformation，但是由于轉化率的緣故，我建議使用電轉儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母(另外常用的還有SMD1168)，每種酵母的特點有些不盡相同(Manual上寫的很清楚)，其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT+表現型，也就是說可以在含甲醇的培養基中快速生長，但是據說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產物免受降解，促進表達量的提高。

一般來說，如果是胞內表達，應盡量用Mut-細胞，這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢 (Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細胞都可應用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同，因此在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。

另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現了轉化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液(每次都要涂平板挑菌)。

在準備酵母菌的同時也需要準備質粒，由于酵母菌轉化對轉化質粒的要求較高，量也較大(5-10μg)，因此許多時候都會用PEG大提質粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。

在轉化前質粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率(EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達)。線性化位點個人認為也會影響到表達量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況，這個時候也不是說不能進行表達，但是準備的質粒就要增加10倍，另外也可以進行部分酶切(即先進行預實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質粒有部分是在線性化位點切開而基因片段保存完好)。

在線性化之后的質粒就可以酒精沉淀回收了――中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔心EDTA對于轉化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風干，這一步需要多加注意保證風干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉化的影響頗大。

接下來就是酵母轉化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關鍵步驟。轉化方法有不少，例如電轉，化學轉化，原生質體轉化，其方法的難易程度和轉化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉最容易，轉化率較高(但要求有電轉儀)，而原生質體最麻煩，而且效果不好(比較傳統)，因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細說明了電轉，化學轉化(EasyComp和LiCl)方法的過程，可以按部就班。需要注意的是：

(電轉過程)

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養過的酵母放置時間不要超過一個星期;

②擴大培養的濃度一定要控制好，個人認為不需要OD600達到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個時候的酵母比較新鮮，轉化率比較高;

③整個感受態制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉化的關鍵――為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉杯都要預冷;

④電轉儀需要預熱，所以準備感受態的時候就可以把電轉儀打開了，電轉后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉化的數量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉后可以看看時間，如果時間過短(比如〈4)就可能說明雜質較多，會影響轉化率;

⑤轉化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養基30℃搖一段時間，可以取部分涂板(不同濃度抗生素)，或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉化率。

(化學轉化)

如果沒有電轉儀，LiCl轉化是一種可供選擇的方法，轉化率是102到103cfu/ug。

主要過程為： 取過夜活化培養的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養基，30℃培養至OD600達到0.8-1.0;4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1ml ，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉化 取適量單鏈鮭精DNA(2mg/ml)煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態細胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入

50%PEG 240ml

1mmol/L LiCl 36 ml

單鏈鮭精DNA 25ml

線性化質粒DNA 10 ml (約10mg)

用吸頭反復吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉化液，細胞沉淀加1ml YPD培養基于30℃ 200 rpm培養2-4hr，取轉化混合液100ml涂布含100μg/ml ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養2-3天。

第三步 ―― 挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR(AOX引物)篩選。

leslie：完成轉化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定(因為比較快)，具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養菌然后進行沸水和-20℃冷凍循環過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內是可以得到好的結果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶(很便宜的酶來的)來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5μl我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養菌的濃度以及用來凍融的菌數量有關。其次是假陽性和假陰性結果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現3.6kb的片段，而Mut+則會出現AOX1基因原本長度的片段――大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區分。

建議PCR過程中使用多對引物進行反應，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較――當然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子的轉錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記(HIS4區的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主(his4)恢復野生型.HIS4區或AOX1區位點的整合都使轉化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS+表型以篩選轉化子.)及3’AOX1區,當整合型載體轉化受體菌感受態細胞時,他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養基中,外源基因在5’AOX1啟動子的控制下表達.

在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉化子,轉化子的拷貝數與抗G418的能力有關,通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩定性.

第四步 ―― 表達

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養基中培育到OD600值達到6.0，就可以離心收菌。用表達培養基(比如BMMY)重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間――不同于大腸桿菌的兩天出結果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉化的酵母菌，另外調整進行重新轉化。

另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照(空質粒)，陽性對照(可以是曾經表達成功的重組子)和沒有進行轉化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養到OD值2-6，離心收菌(如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養基獲得菌)，轉入BMMY中誘導表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味(酸甜的是酵母)，觀顏色(乳白色的是酵母)。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養基就干了，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中――當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3―5層，同時需要注意的是搖瓶內菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復凍融，最好分裝保存――因為蛋白經煮沸變性會不穩定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了(特別是小分子蛋白)，也可以通過調節培養基pH值抑制蛋白水解酶的活性(這一方面說明書講解得詳細)，還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質，競爭性抑制蛋白水解酶的活性來防止表達產物降解。

如果使用的是分泌型培養基，按道理收集培養基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的――除非你的表達蛋白量非常大。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發水分濃縮了。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內蛋白，以防沒有分泌出來。

SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個需要全盤重新準備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎? 系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體(如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統表達出來的蛋白無法發生免疫作用)，可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達中可能出現的情況包括表達量低，沒有分泌表達(針對pPICZa系列)，頭兩天蛋白量較大，無法重復，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結構在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉化，更換線性化位點或者更換菌株;如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產生了競爭表達;畢赤酵母無法重復的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復不了這個結果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢?而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正常現象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。

第五步 ―― 發酵和產物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns(GE Healthcare)，經過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經過純化，我通過一個細胞增殖實驗(cell proliferation assay)檢測了其活性，結果表明表達出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結合活性，與對照(通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發酵罐培養條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養條件，使其產物的表達量與預期的發酵罐培養結果相近。

總而言之，EasySelect系統是一個便于操作的酵母表達系統，我已經使用這一系統表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養液的純化蛋白。