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GST融合蛋白表達與純化的實驗步驟與注意事項
GST表達融合蛋白
載體
pGEX-KG
大小：5006bp，氨芐青霉素抗性(Ampr)，IPTG誘導表達
酶切位點：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
GST分子量：
構建pGEX-KG-YFG重組 質粒
1、分析所感興趣的基因(your favorite gene, YFG)
Primer Premier 5.0軟件，分析YFG含有哪些酶切位點，注意是否與pGEX-KG載體 的多克隆位點有重合
2、確定合適的雙酶切位點
NEB網站(www.neb.com) Double Digest Finder軟件 ，查找最佳雙酶切組合(下表)
| NEB 雙酶切圖譜 | |||
| BamHI | EcoRI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | BamHI may exhibit star activity in this buffer. |
| XbaI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| NcoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ? | |
| SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C | ? | |
| XhoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ? | |
| SmaI | XbaI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XbaI and raise temperature to 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
| NcoI | NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add NcoI and raise temperature to 37°C. | ? | |
| XhoI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XhoI and raise temperature to 37°C. | ? | |
| SacI | NEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add SacI and raise temperature to 37°C. | ? | |
| HindIII | NEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add HindIII and raise temperature to 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| EcoRI | NcoI | NEBuffer EcoRI at 37°C. | ? |
| SalI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | ? | |
| XhoI | NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. | ? | |
| SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | EcoRI may exhibit star activity in this buffer. | |
| HindIII | NEBuffer EcoRI at 37°C. | ? | |
| XbaI | NcoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ? |
| SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| XhoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ? | |
| SacI | NEBuffer 4 + BSA at 37°C. | This buffer is not supplied with either enzyme. At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. | |
| HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ? | |
| NcoI | SalI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ? |
| XhoI | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ? | |
| SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | ? | |
| HindIII | NEBuffer 2 at 37°C. | ? | |
| SalI | XhoI | NEBuffer 3 + BSA at 37°C. | ? |
| XhoI | SacI | NEBuffer 1 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
| HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | ? | |
| SacI | HindIII | NEBuffer 2 + BSA at 37°C. | At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. |
對照YFG、載體多克隆位點，確定上、下游酶切位點
3、設計PCR上、下游引物
Primer Premier 5.0軟件，設計PCR上、下游引物
酶切位點外最多含6個堿基
3’端不是A，最好是G或C，但是不推薦使用GC或CG結尾
3’端至少保證有10個堿基完全配對
得分(Rating)大于70
[注意]
上游引物：是否添加適當堿基，確保不打亂開放閱讀框
下游引物：添加終止密碼子(UAA、UAG、UGA)
4、引物合成及保存
合成：上海生工生物工程技術服務有限公司(Email：beijing@sangon.com，Tel：81767586);純化方法：柱層析or聚丙烯酰胺凝膠電泳?;價格1.30/堿基
保存：貯存濃度：100pmol/μl(100μM)，工作濃度：10pmol/μl(10μM)，-20°C保存
5、PCR擴增YFG
模板：質粒10ng/μl 稀釋少量 -20°C保存
引物：10pmol/μl(10μM) -20°C保存
Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 擴增片段小于2.0kb
反應體系(配制時置于冰上)
| ? | 25μl反應體系 | 50μl反應體系 |
| 模板 | 1μl | 2μl |
| 上游引物 | 1μl | 2μl |
| 下游引物 | 1μl | 2μl |
| 2×Master Mix | 12.5μl | 25μl |
| 去離子H2 O | 9.5μl | 19μl |
反應條件
(1) 預變性 94°C 5 min
(2) 變性 94°C 30 s
(3) 退火 待定 30 s
(4) 延伸 72°C 待定
(5) 重復2-5 25-30個循環
(6) 補平缺口 72°C 10 min
(7) 暫存 10°C
[注意]
退火溫度：參考4(G+C)+2(A+T)-4(互補堿基)，參考Ta Opt(Primer Premier 5.0)
延伸時間：Taq酶：1kb/min
循環數小于30，減少錯配
瓊脂糖電泳檢測PCR產物
0.8%有效分離范圍：10~0.8kb;1.0%有效分離濃度7~0.5kb
50ml TAE加入5μl EB母液(5mg/ml)
100V，30-45min
拍照或者紫外燈下切膠回收
6、構建pGEX-KG-YFG
酶切：雙酶切PCR產物、pGEX-KG
回收：PCR產物直接回收、pGEX-KG電泳之后切膠回收
連接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng
轉化鋪平板：Ampr
挑單克隆：Ampr(四個菌落足夠了)
鑒定：小提質粒酶切 or菌體 PCR
7、轉化BL21(DE3)pLysS菌株檢測GST融合蛋白的表達
(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受態細胞(天根)
(2)2 ml離心管中，加入25μl BL21+ 3μl質粒(300-500ng)，混勻(質粒≤感受態1/10)
(3)冰上放置30min
(4)42°C，90s
(5)冰上放置2-3min
(6)加入300μl LB(無抗生素)(相當于菌體10倍體積的LB)，37°C，250rpm，1 h
(7)4000rpm，2min，棄上清，其余混勻以后涂平板(Ampr)，37°C，過夜(16 h)
(8)挑單克隆菌落，5ml LB(Ampr)，37°C，250rpm，過夜(16 h)
()稀釋10倍、20倍、50倍測定OD600
()選擇合適的稀釋倍數，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，測定OD600
(7)取100μl菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀釋)，37°C，250rpm，過夜(16 h)
(8)取500μl菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀釋)(其余菌液4°C保存)，測OD600
(9)37°C，250 rpm，2 h(OD600：0.6-0.8)，測OD600
(10)室溫放置20 min(搖床降溫，30°C)
(11)取100μl作為誘導前對照，冰上放置
(12)菌液中加入IPTG，終濃度0.5-1 mM
(13)30°C，250 rpm，2 -4h(可做時間梯度)，測OD600
(14)取100μl作為誘導后對照，連同誘導前菌液，12000rpm，離心2min，加入50μl 1×SDS上樣緩沖液
(15)取4ml菌液，12000rpm，離心2min，收集到2ml離心管中
(16)加入1ml GST裂解緩沖液重懸菌體
(17)超聲破碎細胞：超聲20s，間隔10s，共3-5次，超聲強度200-300W(冰浴)
(18)超聲后菌液換入一個新1.5ml離心管，4°C，12000rpm，離心5min
(19)超聲后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上樣緩沖液(其余上清-80°C保存)
(20)超聲后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解緩沖液重懸，取25μl，加入25μl 2×SDS上樣緩沖液(其余沉淀-80°C保存)
(21)將四個樣品煮沸3min，12000rpm，離心5min
(22)8-10%SDS-PAGE，30μl上樣，順序：誘導前菌體、誘導后菌體、超聲后上清、超聲后沉淀
(23)考馬斯亮藍染色
[注意]
(1)菌液OD值小于1即可
(2)誘導時間最好做一個梯度，2-6h
(3)誘導溫度適當摸索，24°C、30°C
(4)IPTG濃度可做梯度，1mM
(5)超聲條件可視實際情況改變，只要使細菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠
8、測序確認
測序引物：pGEX-3通用引物
測序樣品：過夜菌1ml;質粒(濃度大于50ng/μl，10μl)
9、中提質粒(Promega)
10、表達純化GST融合蛋白
(1)已經轉化的菌液，或者重新轉化BL21(DE3)pLysS
(2)活化：取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀釋)，37°C，250rpm，過夜(16 h)
(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀釋)(剩余菌液4°C保存)
(4)37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)
(5)取1ml菌液作為誘導前對照，冰上放置
(6)加入IPTG，終濃度1 mM
(7)30°C，250rpm，誘導適當時間(預實驗確定)
(8)取1ml菌液作為誘導后對照，連同誘導前菌液，12000rpm，離心2min，收集菌體，加入100μl 1×SDS上樣緩沖液
(9)其余菌液，分為兩份，倒入50ml離心管，5000rpm，離心20 min，收集細胞
(10)每管加入8-10ml GST裂解緩沖液重懸菌體，轉移小燒杯中(無氣泡)
(11)超聲破碎細胞：超聲3s，間隔10s，40次左右，超聲強度200-300W(冰浴)
(12)將超聲后菌液轉移到50ml離心管中，4°C，13000rpm，離心20-30min
(13)將上清轉移到1個50ml離心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上樣緩沖液(其余上清-80°C保存)
(14)將沉淀加入16-20ml GST裂解緩沖液(或PBS)重懸，取出50μl，加入50μl 2×SDS上樣緩沖液(其余沉淀-80°C保存)
(15)將四個樣品煮沸3min，12000rpm，離心5min
(16)8-10%SDS-PAGE檢測誘導、超聲是否合適，30μl上樣，順序：誘導前菌體、誘導后菌體、超聲后上清、超聲后沉淀
(17)考馬斯亮藍染色
(18)混勻glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry)，取200μl加入15ml離心管中(2份)
(19)加入10ml PBS，混勻，3000rpm，離心3min，棄上清
(20)加入超聲后上清液，4°C輕柔搖蕩60分鐘(或過夜)(橫放)
(21)4°C，3000rpm，離心3min
(22)10ml GST裂解緩沖液洗滌2次(冰上)
(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗滌2次(冰上)
(24)棄上清，加入1倍柱床體積的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油)，混勻
(25)取懸液測定蛋白濃度或SDS-PAGE
(26)-20°C保存beads
11、GST-Pull-down
(1)10cm培養皿中，未處理的細胞或者轉染的細胞(3-5μg質粒轉染10cm培養皿，Cos-7、293T或者其他細胞，轉染24h)
(2)加入1ml 細胞裂解緩沖液，細胞鏟刮下細胞(冰上)
(3)將裂解液收集到1.5ml離心管中，振蕩30s，冰上放置5min，重復2-3次，充分裂解細胞
(4)4°C，12000rpm，離心15min，收集上清
(5)測定蛋白濃度，取1mg總蛋白做GST-Pull-down?
(6)留30μl作為input對照(input與Pull-down蛋白量約為1/10)
(7)其余溶液，加入20μl glutathione sepharose beads(PBS洗滌過)，4°C，輕柔振蕩20min
(8)12000rpm，離心3min
(9)收集上清，分為兩份，一份加入1-15μg GST結合的beads，另一份加入等量 GST-融合蛋白結合的beads，4°C，輕柔振蕩60min
(10)3000rpm，離心3min，回收上清
(11)1ml 細胞裂解緩沖液洗滌3次
(12)棄盡上清，加入25μl 2×SDS上樣緩沖液
(13)煮沸3min，12000rpm，離心3min
(14)SDS-PAGE，上樣順序：細胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x：LSB)
(15)考馬斯亮藍染色或免疫印跡
[附錄]
GST裂解緩沖液(前四個組分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制劑現用現加)
配方一
| ? | 500ml貯存液 | 10ml工作液 |
| 150mM NaCl | 15 ml 5M NaCl | 10ml貯存液 |
| 20mM HEPES pH7.5 | 20ml 0.5M Hepes pH7.5 | |
| 5mM MgCl2 | 10ml 1M MgCl2 | |
| 1% TritonX-100 | 5ml 100% Triton-X 100 | |
| 1mM DTT | ? | 10μl 1M DTT |
| 1mM PMSF | ? | 34μl 0.3M PMSF |
| inhibitor cocktail | ? | 10μl inhibitor cocktail |
配方二
| ? | 500ml貯存液 | 10ml工作液 |
| 200mM NaCl | ? | 10ml貯存液 |
| 25mM HEPES pH7.5 | ? | |
| 2mM DTT | ? | 20μl 1M DTT |
| 1mM PMSF | ? | 10μl 1M PMSF |
| inhibitor cocktail | ? | 10μl inhibitor cocktail |
TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)
| ? | 500ml 貯存液 | ? |
| 150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | ? |
| 20mM Tris pH7.6 | 10ml 1M Tris pH7.6 | ? |
| 5mM MgCl2 | ? | 0.5M MgCl2 |
| 1mM DTT | ? | 1M DTT |
常用IP細胞裂解液
| ? | 500ml貯存液 | 10ml 工作液 |
| 50mM Tris-HCl, pH7.5 | 25ml 1M Tris-HCl, pH7.5 | ? |
| 150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | ? |
| 2mM EDTA | 2ml 0.5M EDTA | ? |
| 0.5% NP40 | 25ml 10% NP40 | ? |
| 0.5% Triton X-100 | 25ml 10% Triton X-100 | ? |
| 0.5mM DTT | 2.5ml 1M DTT | ? |
| 1mM PMSF | ? | 100μl 100mM PMSF |
| 1mM NaF | 1ml 0.5M NaF | 20μl 0.5M NaF |
| complete protease inhibitors | ? | ? |
cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 μg immobilized GST or GST-32
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