Western轉印的優化

?

從SDS凝膠中進行Western蛋白轉印的優化需要對一系列參數進行考慮。目的是轉印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉移到轉印膜上。進行高效轉印需要一定程度的優化，尤其是對于大分子量和小分子 量蛋白。

轉印后，凝膠上應不殘留或殘留很少的蛋白。可以在轉印后進行染色進行檢測。轉移出凝膠的蛋白應該僅在接觸凝膠的膜的一面可見。如果有懷疑，在轉印時使用第二個"支持膜"，你可以在轉膜后染色，以檢查是否有穿膜的跡象。如果發現蛋白殘留在凝膠上而且膜的結合性很差，可以考慮下列因素：

SDS vs 酒精

在多數轉印實驗步驟中都使用SDS和酒精。但兩者對于成功的轉印有相反的作用，需要根據欲轉印蛋白的性質加以優化。

SDS對于蛋白的遷移是必要的，尤其有助于大分子 量蛋白從凝膠上的轉移。但由于膜結合需要疏水相互作用，SDS過多會抑制結合，尤其對于硝酸纖維素膜。如果從蛋白上剝離太多SDS，將無法將蛋白轉移出膜。作為一個一般性的規則，如果膜的結合力有效，但蛋白仍舊殘留在凝膠上，在轉印緩沖液中加入0.01％會促進完全轉印。建議的步驟在轉印緩沖液中不含有SDS，但凝膠在電泳后不需要浸泡在轉印緩沖液中；凝膠中殘留的SDS對于有效的轉印已經足夠。但另一方面，酒精通過在蛋白上剝離SDS促進蛋白和膜的疏水接合。一般在轉印緩沖液中加入20％的甲醇會增加硝酸纖維素膜的接合能力。

凝膠濃度

丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉移下來。選擇可以分離蛋白的濃度最低的凝膠。梯度膠適用于轉印一系列不同大小的蛋白，因為凝膠的孔與不同大小的蛋白匹配良好。

凝膠厚度

蛋白比較易于從薄膠上轉移下來，所以上樣體積允許，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。

電場（電壓×時間）

如果電壓過低而且轉印時間過短，部分蛋白會殘留在凝膠上。如果電壓過高，小蛋白會在結合到膜上前透膜而出。如果按建議的條件轉印后有蛋白殘留在膠上，增加電壓可能會有幫助，但不要超過5V。但注意，一旦SDS從蛋白剝離，增加轉印時間或提高電壓就無效果。一旦結合，即使延長轉印時間，大部分蛋白也會保持在膜上。

膜的類型

結合到硝酸纖維素膜上主要通過疏水鍵。硝酸纖維素膜對于常規使用非常好。對于小的多肽，建議使用小口徑的膜。

PVDF比硝酸纖維素膜更疏水，在轉印過程中結合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比硝酸纖維素膜需要更嚴謹的封閉條件。其適用于蛋白測序。

尼龍膜通過疏水和靜電相互作用結合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更嚴謹的封閉條件。主要建議用于Northern和Southern。