熒光定量PCR儀技術及其在醫學中的應用

　　1 概述

　　熒光定量多聚酶鏈式反應是一種新的核酸定量技術。該技術將熒光能量傳遞技術(fluorescence resonance energy transfer，FRET)應用于常規多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀中，從而進行定量檢測。FRET即是通過受體發色團之間偶極一偶極相互作用，能量從供體發色團轉移至受體發色團，轉移效率與曲個發色團之間距離的6次冪倒數成比例。與普通定量PCR相比，熒光定量PCR儀具有可實時監測、準確性高、效率高等優點，本文綜述目前國內外幾種熒光定量PCR儀技術及應用。

　　2 熒光定量PCR 方法

　　2.1 TagMan

　　TagMan技術是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能夠裂解雙鏈DNA5 端核苷酸，釋放出單個或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置換了的具有又樣結構的單鏈DNA，水解作用發生于結合了置換部位的磷酸二酯鍵處。基于Tag酶的這種活性，設汁合成一個能與PCR產物雜交的探針，該探針的5 端標記一個熒光分子.3 端標記另一個熒光分子。其中3 端熒光分子能夠吸收5 端熒光分子發出的熒光，因此，正常情況下該探針檢測不到3 端熒光分子的熒光信號，但當溶液中有PCR 產物(模板)時，該針與模板退火，即產生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Tag酶5 外切酶活性，將探針5 端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞了兩熒光分子間的FRET，從而發出熒光，切割的熒光分子數與PCR產物的數量成正比。因此，根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的量。其主要不足是：

　　2.2 Molecular beacon

　　分子信標技術(molecular beacon)也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和淬滅分子，與Tag Man探針不同的是，該探針5 和3 末端自向形成8個堿基左右的發卡結構，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產生熒光。當溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發卡結構，于是溶液便產生了熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。該方法的特點是采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低 其不足之處是：(1)雜交時探針不能完全與模板結合，穩定性差;(2)探針合成時標記較復雜

　　近來，基于Molecular beacon的原理，人們對其進行改進，使用了一種發卡式引物(sunrise primer).此法能將所有擴增產物均標記上熒光分子，因此熒光信號響應快。但無法區分特異和非特異擴增是致命不足 為了克服不足，人們義對其進行改進，發明了一種稱為蝎狀引物(scorpion primer)的熒光定饋PCR技術。該技術在引物與Molecular beacon探針之間連接一個間隔臂，使PCR延伸反應時不能夠延伸至Molecular beacon分了 這樣，非特異擴增產物便無熒光信號，但當有物異擴增產物時， 即可與Molecular beacon進行分了內雜交， 產生熒光信號既解決了非特異問題，又保留了響應快的特點。但仍存在雜交時， 探針不能完全與模板匹配及合成復雜的問題.

　　2.3 Amplisensor

　　Amplisensor是一種復合探針技術，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一種淬滅物。 探針長度不同，其中淬滅物標記探針5 端多出7個堿基(GCGTCCC)。PCR擴增前需將熒光物標記探針與一個半套式PCR引物連接，PCR引物的5 應有一段與長探針互補的序列. 以便連接酶將該引物與短探針連接。擴增時該探針一引物復合物作為半套式引物摻入模板，從而釋放淬滅探針部分，破壞了熒光能量傳遞，產生熒光。熒光的強度與擴增時加入的模板數成正比。該方法主要特點：(1)采用半套式PCR擴增，提高了靈敏度，但無法區分引物二聚體形成產生的非特異擴增信號，使定量準確度受到影響;(2)每次PCR擴增前，要先進行Amplisensor的標記，增加了操作步驟和檢測成本;(3)中間需加入半套式引物，增加了污染機會。

　　2.4 Lightcycler

　　Lightcycler是新近發展起來的一種定量PCR技術，該技術將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上，形成發光探針和淬滅探針，發光探針的5 端與淬滅探針的3 端分別連接熒光分子。兩探針設計為可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交，雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發生FRET使熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此進行定量分析。該方法淬滅效率高，但由于兩個探針結合于模板上，因此影響擴增效率。此外，由于需合成兩個較長探針，合成成本較高。

　　3 在醫學中的應用

　　3.1 病原體測定

　　PCR技術的問世使病原體檢測能夠快速、方便地進行。由于PCR技術假陽性率太高，只要有微量病原體存在就可得到陽性結果，這并不能作為診斷依據， 只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義。因此，對模板準確定量顯得特別重要，應用熒光技術PCR(FQ—PCR)就能夠快速、準確地得到結果。對于解決免疫學檢測的“窗口期”問題，判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態，以及抗體檢測不能判定是現癥感染還是既往感染時，均可利用FQ—PCR進行確定。

　　一些研究資料表明，病原體感染后的發病時間，病情輕重及預后往往與病原體數量相關。如HIV感染后，潛伏期長短、臨床癥狀輕重與血液中病毒量顯著相關，甚至可根據HIV的量比較準確地預測發病時I 。在研究其他病毒感染性疾病是否有類似情況，病原體的致畸和致突變作用是否與病原體的量等有關問題時，也可利用FQ—PCR來闡明。另據研究發現，病毒的數量與某些藥物的療效相關。例如，干擾素對肝炎病毒高拷貝者不敏感，對低拷貝者敏感。因此利用FQ—PCR對某些病毒的定量分析可指導臨床用藥和制定治療方案。

　　3.2 腫瘤研究

　　盡管腫瘤發病的分子機制尚未完全闡明，但相關基因的遺傳學改變的積累是致癌性轉變的根本原因已得到普遍承認。癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就可出現，FQ—PCR 不但能有效地檢測基因的突變，而且能準確測定表達量，據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預后判斷。某些癌基因的遺傳學變化的檢測幾乎達到確診腫瘤的程度。例如，CD 基因的異常拼接表達，幾乎只有出現于某些泌系腫瘤。對于有慢性骨髓性白血病都可檢測到原癌基因易位導致的BCR/ABL融合基因形成，FQ—PCR技術不但可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達而進行腫瘤診斷，還可檢測治療中和治療后微量殘余惡性細胞存在的數量，以此作為治療效果和估計復發的危險性的依據。

　　3.3 其他方面

　　在基因表達研究中， 由于FQ—CPR的應用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法， 如Northem印跡、RT—PCR定量法要方便、快速、準確得多。在免疫組分析中，對免疫T細胞群體V—p組織進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段。利用FQ—PCR技術進行分析，克服了原來分析方法如流式細胞法、競爭性PCR技術等操作復雜，準確性低，污染嚴重的缺點。

　　4 結語

　　綜上所述，FQ—PCR作為一種核酸定量技術，在以前的PCR技術上得到進一步發展，大大降低了假陽性率，工作效率高，結果重現性好，且不必使用對人體有害的染色劑。FQ—PCR應用較多且較成熟主要是在病原體檢測方面，其優越性在此也得以充分體現。因此將其應用于臨床具有很大潛力。在腫瘤、遺傳病研究，尤其是基因表達方面的研究，該技術應用還較少，在這方面加強研究應用，將會有廣闊的前景。將生物基因芯片技術與FQ—PCR技術結合，有助于PCR技術的進一步完善，推動該技術的發展、應用。