PCR產物常規純化方法

       大批量、廉價、用于測序的PCR產物純化方法--PEG沉淀

　　最近，摸索了一下PEG沉淀PCR產物的方法，貼出來，與大家共享。

　　目的：探索一種方法，能將PCR產物大批量地、廉價地、純度比較高地純化出來，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA測序。

　　有文獻和方法說，不同濃度的PEG能沉淀不同長度的DNA，所以，先做了一下不同PEG濃度對DNA沉淀的作用，見下圖，標本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在純水里面的，下一行Marker溶解在模擬的PCR反應體系里面的(除了沒加Taq，其他與常規PCR一致)，此目的是驗證一下PCR體系里面的鹽離子對PEG沉淀是否有影響。

　　總起來，結果還比較滿意，可以看到，PEG濃度越高，能沉淀出來的DNA片段越小，并且，PCR反應體系里面的鹽離子對PEG沉淀影響似乎不大，我測序的標本都在300bp以上，所以，最終選擇的PEG濃度為12%。

　　方法： 96孔PCR板操作。

　　1、20μLPCR產物加入5μL 5M的NaCl(終濃度0.5M);

　　2、加入25μL 24%的PEG8000溶液(終濃度12%);混勻;

　　3、4度放置30min;

　　4、4500xg，4度離心30min后，立即將板反扣在厚的吸水紙上，離心至150xg，去除上清;

　　5、加入70μL 75%EtOH，4500xg，4度離心15min，立即再板反扣在厚的吸水紙上，離心至150xg，去除上清;重復一次;

　　6、50度或室溫干燥，加入10μL ddH2O溶解，即為純化的PCR產物，測序時取1μL做模板。

　　討論：

　　1、此方法能直接用96孔PCR板操作，能大批量純化PCR產物，并且，純度較高，可以去掉300bp以下的PCR非特意產物。曾經用96孔板，用傳統的酒精醋酸鈉沉淀純化過PCR產物，可惜非特意擴增產物、引物二聚體和沒有消耗完的引物都純化出來了，對測序造成嚴重的干擾。

　　2、此方法純化的成本很低，PEG8000、NaCl、酒精，差不多是實驗室常規試劑，比96孔板純化kit要便宜多得多，另外的突出的優點是能將200bp以下的片段去掉，我的一批標本有一個180bp的非特異產物，用此方法很方便的去掉了，測序結果很不錯。

　　3、此方法有一點不好處，就是得率較低，大家可以比較下圖，左邊的Marker加了1μg，其他標本是2μg的Marker純化后的所有產物，純化得率也就是30%。好在測序不需要很多DNA，對測序來說，已經足夠了。