高通量藥物篩選模型在酶抑制劑篩選上的應用

酶抑制劑的開發是新藥開發的重要來源，對于酶抑制劑的藥物篩選模型建立來說，動物模型由于規模小、效率低、樣品量大、成本高等缺點，不適合作為藥物初篩的模型。細胞和分子水平的高通量藥物篩選模型，具有材料用量少、藥物作用機制比較明確，可以實現大規模篩選和一藥多篩等特點，已經廣泛應用于酶抑制劑藥物的篩選上來。

酶抑制劑是指特異性作用于酶的某些基團，降低酶的活性甚至使酶完全喪失活性的物質，是很多外來化合物產生毒作用的機理。由于抑制特定酶的活性可以殺死病原體或校正新成代謝的不平衡，許多相關藥物就是酶抑制劑。

高通量篩選是今年來迅速發展起來的藥物篩選技術，它通過運用基因科學、蛋白質科學、分子藥理學、細胞藥理學、微電子技術等多學科理論和技術，以及與疾病相關的酶和受體為作用靶點，對天然或合成化合物進行活性測試，并在此基礎上進行篩選。臨床前CRO公司美迪西在抗腫瘤、免疫性疾病、抗炎、心血管疾病、鎮痛和糖尿病等研究領域建立了相對成熟的藥物篩選模型，既包括微量、快速、高自動化的新型高通量初篩模型，又包括深入篩選的各級復篩模型，形成了高效、多層次的新藥篩選平臺。

酶抑制劑的高通量藥物篩選模型，主要為分子水平的篩選模型，也有少量細胞水平的篩選模型。篩選以酶為作用靶點的藥物，不僅要觀察酶與藥物的結合，更要觀察藥物對酶活性的影響。根據酶的特點，酶的反應底物和產物都可作為檢測指標。以酶為作用靶點的高通量檢測方法，絕大多數是直接檢測酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、熒光的方法兩大類。

1、高通量藥物篩選模型在5-脂氧化酶抑制劑篩選上的應用

炎癥是引起動脈粥樣硬化、腫瘤、骨質疏松、哮喘等疾病的重要生理過程，5-脂氧化酶是催化花生四烯酸生成白三烯類炎癥介質的關鍵酶，是抗炎藥物研發的重要靶點。以花生四烯酸為底物，以2,7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸為反應物，建立了非鐵離子螯合機制和鐵離子螯合機制的兩種5-脂氧化酶抑制劑的高通量藥物篩選模型。經對酶濃度、反應時間等多種條件的實驗、優化和陽性藥驗證，該模型具有較高的靈敏度和穩定性。

利用建立的非鐵離子螯合機制篩選模型，從15200株真菌代謝產物中篩選得到35個陽性菌株，從16702株放線菌代謝產物中篩選得到23個陽性菌株。利用建立的兩種篩選模型從2833個單體化合物中篩選到9個有活性的化合物。化合物F01WB287C為鐵離子螯合型抑制劑，其IC50值為2μM。化合物F02ZA2396B為非鐵離子螯合型抑制劑其IC50值為5.36μM。化合物F02ZA2554A、1833-7、1833-27、F01WA960A、F01WB1695B、1914-1和868通過鐵離子螯合和其它機制共同起抑制作用。9個化合物中F02ZA2554A、F01WA960A和F01WB1695B對5-脂氧化酶的抑制活性和陽性藥齊留通相當。

該研究篩選到的9個化合物對5-脂氧化酶的抑制活性均未見報道。該研究建立的5-脂氧化酶抑制劑高通量藥物篩選模型以及篩選得到的9個新的5-脂氧化酶抑制劑為抗炎藥物的研究和開發打下了堅實的基礎。

2、高通量篩選模型在流感病毒神經氨酸酶抑制劑篩選上的應用
　　曹鴻鵬等采用熒光分析法建立了流感病毒神經氨酸酶抑制劑的高通量篩選模型，從甲型及乙型流感病毒中制備出神經氨酸酶，以有熒光特性的化合物為酶的底物，利用96孔板建立了適合高通量篩選神經氨酸酶抑制劑的熒光分析法。方法是96孔板中，100 μl體系中含有20 μmol/L MUNANA（底物），3 μl神經氨酸酶溶液，10 μl待測樣品溶液，37℃，pH 3.5，孵育15 min，355/460 nm測定熒光強度。
3、高通量篩選模型在α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選上的應用

有研究者采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選模型。從小腸上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖為底物，通過測定體系中葡萄糖的生成量來檢測α-葡萄糖苷酶的活性。方法是384孔微板中，20 μl體系中含有10 μl酶提取液，30 mmol/L的蔗糖5 μL，待測樣品5 μl，37℃，孵育30 min，505 nm波長下測定吸光度。李婷等也建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選模型。方法是96孔板中，160 μl體系含2.5 mmol/L和0.2 U/ml α-葡萄糖苷酶，37℃，pH 7.0，反應15 min，400 nm波長處測定吸光度。

4、以青霉素結合蛋白（PBP）為靶的抗生素的高通量篩選方法
　　Vollmer等采用放射法建立了一種以青霉素結合蛋白（PBP）為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉移酶又是肽轉移酶，該法是篩選其糖基轉移結構域的活性位點上的可結合物。方法是96孔板中加入莫諾霉素混懸液，然后加入3H標記的PBP（細菌膜粗提物）和受試化合物，孵育，過濾去掉非結合的放射性，閃爍計數測得放射性指示PBP與莫諾霉素結合的情況及受試化合物對其的影響。

5、醛糖還原酶抑制劑的高通量藥物篩選模型建立
　　另外，根據酶的特點，還有一些特殊的方法。肖尚志建立了醛糖還原酶抑制劑的高通量篩選模型。組織貼塊法培養大鼠主動脈平滑肌細胞至8～15代時，用胰蛋白酶消化后，接種至24孔板，加入胎牛血清濃度為10%、葡萄糖濃度為37.5 mmol/L的培養液，含藥血清20 μl，孵育48 h后，收集細胞，離心取上清液，與輔酶NADPH加上足量的底物在一定緩沖體系中反應。由于NADPH為自身含有熒光的物質，故反應后，高效液相色譜367/455 nm波長下檢測熒光強度便可反映NADPH的消耗情況，從而推算出醛糖還原酶的活性。Hammonds等建立了真核生物拓撲異構酶Ⅱ抑制劑的高通量篩選方法。啤酒酵母菌株經改造后使表達人拓撲異構酶Ⅱα或Ⅱβ。將細胞與受試藥物在96孔板上孵育后，在630 nm波長處測其吸收度值，從而檢測藥物對細胞生長情況及酶活性的影響。
　　高通量篩選模型已成功應用于p56lck激酶、DNA拓撲異構酶、醛糖還原酶、神經氨酸酶、環氧化物水解酶、轉谷氨酰胺酶等抑制劑的篩選。高通量篩選具有快速、高效、經濟、高特異性等優點，其中所用的樣品量較少，因此其不僅適用于酶抑制劑藥物的篩選上來，還尤其適用于天然化合物的活性篩選。