酪氨酸蛋白激酶活性分析方法

蛋白酪氨酸激酶（PTK）是控制細胞生長和分化的重要蛋白質，是在正常和異常增殖過程中起重要作用的癌蛋白和原癌蛋白家族中的成員，它在細胞癌變過程中起著至關重要的作用。因此，建立簡單實用的酪氨酸蛋白激酶酶活性分析方法對于疾病早期診斷及靶向藥物開發都具有重要的意義，目前我國也有不少的公司提供酶活性檢測服務。

蛋白激酶（ProteinKniases）作為細胞生命活動重要的信號使者，是實現細胞功能的關鍵調節劑之一，它構成了最大和功能最多樣的基因家族之一。蛋白激酶能夠參與眾多生理過程，包括細胞增殖、存活、凋亡、代謝、轉錄以及分化等。因此，蛋白激酶被認為是治療人類疾病，如癌癥、炎癥、心血管疾病或糖尿病的重要靶標。

酪氨酸蛋白激酶抑制劑可作為三磷酸腺苷（ATP）與酪氨酸蛋白激酶結合的競爭性抑制劑，也可作為酪氨酸的類似物阻斷表皮生長因子受體的肽位點和酪氨酸蛋白激酶的編碼，抑制細胞增殖，可望開發為抗腫瘤藥物，但對完整細胞沒有表現出選擇性。目前臨床上最常用的針對BCR-ABL酪氨酸激酶小分子抑制劑（TKI）包括第一代藥物伊馬替尼，第二代藥物達沙替尼（施達賽?）和尼羅替尼，酪氨酸激酶抑制劑主要通過抑制BCR-ABL融合蛋白，從而發揮抗白血病作用。

我國國內的研究團隊基于酪氨酸酶的氧化調控機制設計了一種簡單、靈敏且通用性強的熒光增強型酪氨酸蛋白激酶的活性分析方法。該方法的檢測原理如下：首先針對靶標（PTK）設計合成其熒光標記的多肽底物。當體系在沒有PTK存在的情況下，酪氨酸酶能夠將多肽底物的酪氨酸殘基氧化成鄰二苯醌，進而通過電子轉移機制（ET）猝滅多肽上標記的熒光基團，體系的熒光減弱。隨著PTK的引入，酪氨酸殘基的酚羥基被磷酸基團保護起來，從而使其不再能夠被酪氨酸酶氧化，使得多肽底物保持較強的熒光信號，體系的熒光強度隨PTK活性增大而增強。因此，通過測定體系的熒光信號強弱即可直觀地檢測PTK活性。

該設計巧妙地將酪氨酸酶對酚羥基的特異性催化氧化能力用于磷酸化和未磷酸化的酪氨酸殘基的識別，同時結合氧化產物鄰二苯醌可以對熒光基團產生猝滅這一現象，成功實現了簡單、靈敏的熒光增強型PTK活性檢測。該方法操作簡單，只需要將酪氨酸酶與PTK反應體系混合后測量體系的熒光即可，大大簡化了操作流程。此外，針對不同靶標PTK，合理設計相應的特異性多肽底物，可使其普遍適于不同種類PTK的活性分析。同時，該方法不僅可以用于酪氨酸蛋白激酶活性的檢測，而且在藥物篩選等方面也具有很好的應用前景。

    目前我國不少的醫藥研發外包公司提供酶活性檢測服務，例如美迪西。美迪西生物部在體外生物學領域有豐富廣泛的經驗，通過酶水平測定、細胞水平測定、細胞生物學、生物化學、體外同位素測定、穩定細胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術等，提供一套完整的生物學服務。