生化實驗講義(理論部分)一－－緒論（二）

上一篇 / 下一篇 2008-09-26 12:13:39/ 個人分類：生化檢驗

⑶ 微量進樣器

微量進樣器常用作氣相和液相色譜儀的進樣器，在生化實驗中主要是用作電泳實驗的加樣器，通常可分為無存液和有存液兩種。

1) 0.5L ～5L無存液微量進樣器：進樣器的不銹鋼芯子直接通到針尖端處，不會出現存液，所以可用于5?L以下的極微量液體進樣。

2) 10L～100L有存液微量進樣器：不銹鋼的針尖管部分是空管，進樣器的柱塞不能到達，因而管內會存有空氣或液體，其使用注意事項是：① 不可吸取濃堿溶液，以免腐蝕玻璃和不銹鋼零件。 ② 因為有存液，所以吸液時要來回多拉幾次，將針尖管內的氣泡全部排盡。 ③ 針尖管內孔極小，使用后，尤其是吸取過蛋白質溶液后，必須立即清洗針尖管，防止堵塞。若遇針尖管堵塞，不可用火燒，只能用φ0.1mm的不銹鋼絲耐心串通。 ④ 進樣器未潤濕時不可來回干拉芯子，以免磨損而漏氣。 ⑤ 若進樣器內發黑，有不銹鋼氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，來回拉幾次即可除之。

⑷ 自動取液器

這種取液器在生化實驗中大量地使用，它們主要用于多次重復的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的準確度(即容量誤差)為 ±(0.5%～1.5%)，移液的精密度(即重復性誤差)更小些，為 ≤0.5%。

取液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有100?l 、200?L和1000?L等幾種;另一種是可調容量的取液器，常用的有200?L、1000?L和5000?L等多種規格。每種取液器都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是一次性使用，當然也可以超聲清洗后重復使用，而且此種吸頭還可以進行120℃高壓滅菌。

可調式自動取液器的操作方法是用拇指和食指旋轉取液器上部的旋鈕，使數字窗口出現所需容量體積的數字，在取液器下端插上一個塑料吸頭，并旋緊以保證氣密，然后四指并攏握住取液器上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，向下按到第一停點，將取液器的吸頭插入待取的溶液中，緩慢松開按鈕，吸上液體，并停留1～2秒鐘(粘性大的溶液可加長停留時間)，將吸頭沿器壁滑出容器，用吸水紙擦去吸頭表面可能附著的液體，排液時吸頭接觸傾斜的器壁，先將按鈕按到第一停點，停留一秒鐘(粘性大的液體要加長停留時間)，再按壓到第二停點，吹出吸頭尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸頭，可按下除吸頭推桿，將吸頭推入廢物缸。

自動取液器的使用注意事項是： ① 吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入取液器內腐蝕柱塞而造成漏氣。 ② 為獲得較高的精度，吸頭需予先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因為吸取血清蛋白質溶液或有機溶劑時，吸頭內壁會殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產生誤差。③ 濃度和粘度大的液體，會產生誤差，為消除其誤差的補償量，可由試驗確定，補償量可用調節旋鈕改變讀數窗的讀數來進行設定。④ 可用分析天平稱量所取純水的重量并進行計算的方法，來校正取液器，1mL 蒸餾水20℃時重0.9982g。

1.6 緩沖溶液與pH測定

緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑(即純水)所得的溶液，溶液內所溶解的溶質(化合物)稱之為緩沖劑，調節緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。

緩沖溶液的正確配制和pH值的準確測定，在生物化學的研究工作中有著極為重要的意義，因為在生物體內進行的各種生物化學過程都是在精確的pH值下進行的，而且受到氫離子濃度的嚴格調控，能夠做到這一點是因為生物體內有完善的天然緩沖系統。生物體內細胞的生長和活動需要一定的pH值，體內pH環境的任何改變都將引起與代謝有關的酸堿電離平衡移動，從而影響生物體內細胞的活性。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環境，就必須保持體外生物化學反應過程有體內過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學的各種研究工作中和生物技術的各種開發工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質，準確恰當地選擇和配制各種緩沖溶液，精確地測定溶液的pH值，就是非常重要的基礎實驗工作。下表列出某些人體體液的pH值：

表1—3 人體體液pH

體液 pH 體液 pH

血清 7.35～7.45 大腸液 8.3～8.4

成人胃液 0.9～1.5 淚 6.6～6.9

唾液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5

胰液 7.5～8.0 腦脊液 7.35～7.45

1.6.1 基本概念

⑴又稱酸堿質子理論。1923年由丹麥化學家J.N.Br?nsted和英國化學家T.M.Lowry同時提出了酸堿質子學說，發展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質子理論或Br?nsted-Lowry酸堿理論。他們認為凡能釋放質子的分子或離子(如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等)稱為酸，凡能接受質子的分子或離子(如：H2O，NH3，Cl—等)稱為堿。因此，一種酸釋放質子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質子結合后，形成對應的酸，稱為該堿的共軛酸。

⑵ 緩沖體系的設計：

強電解質溶于水幾乎全部解離為正負離子，弱電解質溶于水時，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸(HA)及其鹽溶于水時，只有部分HA解離為 H+ 和 A—離子

1.6.2 生物化學常用緩沖液

⑴ 磷酸鹽緩沖液

磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬：

NaH2PO4： pKa1=2.12， pKa2=7.21

Na2HPO4： pKa1=7.21， pKa2=12.32

配酸性緩沖液：用 NaH2PO4，pH=1～4，

配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH=6～8，

配堿性緩沖液：用 Na2HPO4，pH=10～12。

用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因為SDS(十二烷基硫酸鈉)會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。

磷酸鹽緩沖液的優點為：①容易配制成各種濃度的緩沖液;②適用的pH范圍寬;③pH受溫度的影響小;④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。

其缺點為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀;②會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用會產生某種程度的抑制作用。

⑵Tris(三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane)緩沖液

Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。

Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：

Tris-HCl緩沖液： pH=7.5～8.5

Tris-磷酸鹽緩沖液： pH=5.0～9.0

配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標準濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法;②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11g Tris堿溶于950mL～970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加4N HCl，用pH計測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補足到1L。

Tris-HCl緩沖液的優點是： ①因為Tris堿的堿性較強，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液;②對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發生沉淀。

其缺點是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1;②溫度效應大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，例如：4℃時緩沖液的pH=8.4，則37℃時的pH=7.4，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴密封。 ④此緩沖液對某些pH電極發生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

⑶ 有機酸緩沖液

這一類緩沖液多數是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH=3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。

甲酸～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發性強，使用后可以用減壓法除之。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個pKa值：pKa1=3.10，

pKa2=4.75， pKa3=6.40。琥珀酸有二個pKa值：pKa1=4.18， pKa2=5.60。

有機酸緩沖液的缺點是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產物，因而對生化反應過程可能發生干擾作用;②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子(Fe3+、Zn++、Mg++等)結合而使緩沖液受到干擾;③這類緩沖液易與Ca++離子結合，所以樣品中有Ca++離子時，不能用這類緩沖液。

⑷ 硼酸鹽緩沖液

常用的有效pH范圍是：pH=8.5～10.0，因而它是堿性范圍內最常用的緩沖液，其優點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產物形成絡合物，尤其是能與糖類的羥基反應生成穩定的復合物而使緩沖液受到干擾。

⑸ 氨基酸緩沖液

此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：

甘氨酸—HCl緩沖液：pH=2.0～5.0，

甘氨酸—NaOH緩沖液：pH=8.0～11.0，

甘氨酸—Tris緩沖液：pH=8.0～11.0，(此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液)，

組氨酸緩沖液：pH=5.5～6.5，

甘氨酰胺(glycine amide)緩沖液：pH=7.8～8.8，

甘氨酰甘氨酸(glycylglycine)緩沖液：pH=8.0～9.0。

此類緩沖體系的優點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環境。其缺點是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學反應過程，如代謝過程等。②試劑的價格較高。

⑹ 兩性離子緩沖液(Zwitterionic buffers)，又稱Good’s緩沖液

1960年，N.E.Good和他的同事們總結了現有的各種緩沖試劑的優缺點后認為，必須用人為設計和人工合成的方法來找到專門用于生命科學研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Good’s緩沖液可查閱有關的資料。

Good’s緩沖液的主要優點是不參加和不干擾生物化學反應過程，對酶化學反應等無抑制作用，所以它們專門用于細胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋白質和酶的研究工作。其缺點是：①價格昂貴，②對測定蛋白質含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因為它們會使空白管的顏色加深。

1.6.3 pH值的測定

測定溶液pH值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1～14、9～14等，只能粗略確定溶液的pH值。另一種是精密pH試紙，可以較精確地測定溶液的pH值，其變色范圍是2～3個pH單位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等許多種，可根據待測溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。測定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙(不可用手拿，以免污染試紙)，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對照，估讀出所測pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。也可將試紙塊放在白色點滴板上觀察和估測。試紙要存放在有蓋的容器中，以免受到實驗室內各種氣體的污染。

精確測定溶液pH值要使用pH計，其精確度可達0.005pH單位，關鍵是要正確選用和校對pH電極。過去是使用兩個電極，即玻璃電極和參比電極(甘汞或銀—氯化銀電極)，現在它們已淘汰，被兩種電極合一的復合電極所代替。

玻璃電極對溶液中的氫離子濃度敏感，其頭部為一薄玻璃泡，內裝有0.1N HCl，上部由銀～氯化銀電極與鉑金絲聯結。當玻璃電極浸入樣品溶液時，薄玻璃泡內外兩側的電位差取決于溶液的pH，即玻璃電極的電極電位隨樣品溶液中氫離子濃度(活度)的變化而變化。

參比電極的功能是提供一個恒定的電位，作為測量玻璃電極薄玻璃泡內外兩側電位差的參照。常用的參比電極是甘汞電極(Hg/HgCl)或銀—氯化銀電極(Ag/AgCl)。參比電極電位是氯離子濃度的函數，因而電極內充以4M KCl或飽和KCl，以保持恒定的氯離子濃度和恒定的電極電位。使用飽和KCl是為使電極內沉積有部分KCl結晶，以使KCl的飽和濃度不受溫度和濕度的影響。

現在pH測定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復合電極，即將它們共同組裝在一根玻璃管或塑料管內，下端玻璃泡處有保護罩，使用十分方便，尤其是便于測定少量液體的pH值。

使用時應注意：

⑴經常檢查電極內的4mol/L KCl溶液的液面，如液面過低則應補充4mol/L KCl溶液。

⑵玻璃泡極易破碎，使用時必須極為小心。

⑶復合電極長期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平時可浸泡在無離子水或緩沖溶液中，使用時取出，用洗并沖洗玻璃泡部分，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待測溶液中，稍加攪拌，讀數時電極應靜止不動，以免數字跳動不穩定。

⑷使用時復合電極的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。

⑸使用前要用標準緩沖液校正電極，其數據見書后附錄，常用的三種標準緩沖液是pH=4.00、6.88和9.23(20℃)，精度為±0.002pH單位。校正時先將電極放入6.88的標準緩沖液中，用pH計上的“標準”旋鈕校正pH讀數，然后取出電極洗凈，再放入4.00或9.23的標準緩沖液中，用“斜率”旋鈕校正pH讀數，如此反復多次，直至二點校正正確，再用第三種標準緩沖液檢查。標準緩沖液不用時應冷藏。

⑹電極的玻璃泡容易被污染。若測定濃蛋白質溶液的pH值時，玻璃泡表面會覆蓋一層蛋白質膜，不易洗凈而干擾測定，此時可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡過夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若電極保存時間過長，校正數值不準時，可將電極放入2mol/L KCl 溶液中，40℃加熱一小時以上，進行電極活化。

pH測定時會有幾方面的誤差：

⑴鈉離子的干擾：多數復合電極對 Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的堿性溶液，Na+ 的干擾更加明顯。例如，當Na+ 濃度為0.1mol/L時，可使pH值偏低0.4～0.5單位。為減少Na+ 對pH測定的干擾，每個復合電極都應附有一條校正Na+干擾的標準曲線，有的新式的復合電極具有Na+ 不透過性能，如無以上兩個條件，則可以將電極內的KCl換成NaCl。

⑵濃度效應：溶液的pH值與溶液中緩沖離子濃度和其他鹽離子濃度有關，因為溶液pH值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相等。生化實驗中經常配制比使用濃度高十倍的“貯液”，使用時再稀釋到所需濃度，由于濃度變化很大，溶液pH會有變化，因而稀釋后仍需對其pH進行調整。

⑶溫度效應：有的緩沖液的pH值受溫度影響很大，如“Tris”緩沖液，因而配制和使用都要在同一溫度下進行。

1.7 生化實驗室的基本設施與裝備

1.7.1 溫度與環境設施

許多生化實驗都要求在一定的溫度和濕度下進行操作，因此，一個正規的生化實驗室必須能夠保持恒溫、恒濕的環境。為了保持這些條件，實驗室都應裝備空調和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實驗室必須備有4℃、-20℃、-80℃的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對于需在較高溫度下進行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實驗室還應備有干冰，以便使用乙醇～干冰浴進行樣品的快速冷凍分裝。

1.7.2 實驗室用純水

生化實驗室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實驗用試劑不能用自來水，只能使用經過純化的水。生化實驗對所用水的純度是要求比較高的，通常可以認為，水的質量越高，實驗的結果就越真實可靠和準確，為此必須保證實驗用水的質量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。在超純分析和特殊的生化實驗中要求更高的水質，如15～18 MΩ-cm高純無離子水、無熱源高純水、無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。

實驗室制備無離子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型強酸性陽離子交換樹脂和聚苯乙烯季胺型強堿性陰離子交換樹脂填充的陽離子和陰離子交換柱，或是陰、陽離子交換樹脂的比例為2∶1的混合柱。無離子水的水質用電阻率表示，最高純度是18 MΩ-cm(25℃)。雖然無離子水中陰、陽離子的含量可以很低，但用離子交換法卻不能去除水中的有機物雜質，離子交換樹脂中的低分子有機化合物亦可能溶于水，因此由無離子水的電阻率不能看出水中有機物的污染程度，有機物的污染有可能干擾生化實驗中的某些反應，也會使水的紫外吸收增加，對于那些對紫外吸收要求十分嚴格的實驗，應選用蒸餾水而不用無離子水。

實驗室中制備蒸餾水，多采用石英管加熱的硬質玻璃蒸餾水器，蒸餾時不能用自來水，因為會產生水垢，最好用無離子水作為水源。如欲除去有機物，可在蒸餾水器中每升水加1g高錳酸鉀和1mL 85%的磷酸，以便通過氧化除去有機物。不含金屬離子的水，需用亞沸蒸餾水，即用石英亞沸蒸餾器進行蒸餾，其特點是在液面上方加熱，但水并不沸騰，只是液面處于亞沸狀態，可將水蒸氣帶出的雜質減至最低，但制水量較小，每小時約1～4升。

實驗工作中不應盲目追求水的純度，水的價格隨水質的提高而成倍地增長，因此要根據實際工作的需要，即所用水中應排除的干擾物質的類型，來選用水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。

所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產生有紫外吸收的有機物;玻璃和金屬容器會產生金屬離子的污染;長時間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴，必要時貯存在冰箱的冷藏室中。

1.7.3 消毒系統

生化實驗要進行生物培養和生物反應的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實驗之前，都必須對實驗中用到的、可能造成污染的材料、器械等進行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實驗室必須配備各種無菌處理設備。

1.7.4 計量系統

生化實驗都要求在各種標準的定量條件下進行，因此實驗室必須配備各種標準的定量系統。常用的定量系統有：稱量系統、液體體積度量系統、pH測定系統、液體溶質定量系統等。

⑴ 稱量系統：最常用的設備是各種千分之一的扭力天平、電子天平和各種萬分之一的單、雙盤天平和電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制和標準物質的稱量等。

⑵ 液體體積度量系統：常用的有各種量筒、移液管、容量并、微量進樣器和各種自動取液器等。

⑶ 酸堿度pH測量系統：最常用的是pH試紙和pH計。

⑷ 液體溶質定量系統：此系統主要是根據液體溶質的某些理化特性而設計的，不同的物質在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關系，可以通過測定某物質在溶液中的吸收光譜來計算出該物質的濃度，因而分光光度計就是生化實驗室必備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計、紫外/可見分光光度計和高檔的快速掃描紫外/可見分光光度計等。

1.7.5 離心設備

離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實驗室必須備有各種形式的離心機。常用的有普通臺式離心機、高速冷凍離心機和超速離心機等。

1.7.6 電泳裝置

電泳是生化實驗中最常用最重要的實驗技術之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第4章。

1.7.7 層析裝置

層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統和核酸蛋白檢測器就是生化實驗室最常用的儀器設備。主要的層析技術有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見第3章。

1.7.8 光密度儀

激光光密度儀是適用于多種電泳結果分析的儀器。它采用激光為光源，色散性強，線性范圍廣，分辨率高，所得結果可以在電腦中進行多維的圖象處理，并打印出結果，在生化實驗室中正得到越來越廣泛的使用。

1.7.9 真空印跡系統

該設備是一種利用真空原理將已經分離的生物大分子(蛋白質、核酸)從電泳后的凝膠中轉移到膜上的儀器，主要由印跡儀和真空印跡泵組成，印跡效率接近100%，重復性好，方法簡易、快速，將轉移分子的變性、中和、印跡等所有步驟均在印跡儀中完成，從而避免了凝膠受損。

1.7.10 核酸自動合成儀與測序儀

用于DNA、RNA的自動合成及序列測定。