生化實驗講義(理論部分)三－－層析技術（二）

3.3 離子交換層析

3.3.1 簡介

離子交換層析(Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC)是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

3.3.2 基本原理

離子交換層析是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用，稱為陽離子交換劑;平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用，稱為陰離子交換劑。離子交換反應可以表示為：

陽離子交換反應：( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?

陰離子交換反應：( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?

其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質，X? 和X? 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團，Y? 和Y? 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，A? 和A? 分別代表溶液中的離子基團。

從上面的反應式中可以看出，如果A離子與離子交換劑的結合力強于Y離子，或者提高A離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團結合到固定相上，而平衡離子則進入流動相，這就是離子交換層析的基本置換反應。通過在不同條件下的多次置換反應，就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。

陰離子交換劑的電荷基團帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負電的平衡離子結合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。加樣后，負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應，而結合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結合，隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換，而將各種負電基團置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結合力小的負電基團先被置換出來，而與離子交換劑結合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來，這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達到分離目的。

各種離子與離子交換劑上的電荷基團的結合是由靜電力產生的，是一個可逆的過程。結合的強度與很多因素有關，包括離子交換劑的性質、離子本身的性質、離子強度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結合力的差異，并通過改變離子強度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結合力而達到分離的目的。離子交換劑的電荷基團對不同的離子有不同的結合力。一般來講，離子價數越高，結合力越大;價數相同時，原子序數越高，結合力越大。如陽離子交換劑對離子的結合力順序為：Li? < Na? < K? < Rb? < Cs? ;Na? < Ca2? < Al3? < Ti4? 。蛋白質等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結合與它們的性質及pH有較大關系。以用陽離子交換劑分離蛋白質為例，在一定的pH條件下，等電點pI < pH的蛋白帶負電，不能與陽離子交換劑結合;等電點pI > pH的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結合，一般pI越大的蛋白與離子交換劑結合力越強。但由于生物樣品的復雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結合情況較難估計，往往要通過實驗進行摸索。

3.3.3 離子交換劑的種類和性質

1. 離子交換劑的基質

離子交換劑的大分子聚合物基質可以由多種材料制成，聚苯乙烯離子交換劑(又稱為聚苯乙烯樹脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網狀結構的聚苯乙烯為基質。聚苯乙烯離子交換劑機械強度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素(Cellulose)、球狀纖維素(Sephacel)、葡聚糖(Sephadex)、瓊脂糖(Sepharose)為基質的離子交換劑都與水有較強的親和力，適合于分離蛋白質等大分子物質，葡聚糖離子交換劑一般以Sephadex G-25和G-50為基質，瓊脂糖離子交換劑一般以Sepharose CL-6B為基質。關于這些離子交換劑的性質可以參閱相應的產品介紹。

2. 離子交換劑的電荷基團

根據與基質共價結合的電荷基團的性質，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。

陽離子交換劑的電荷基團帶負電，可以交換陽離子物質。根據電荷基團的解離度不同，又可以分為強酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區別在于它們電荷基團完全解離的pH范圍，強酸型離子交換劑在較大的pH范圍內電荷基團完全解離，而弱酸型完全解離的pH范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時就失去了交換能力。一般結合磺酸基團(?SO3H)，如磺酸甲基(簡寫為SM)、磺酸乙基(SE)等為強酸型離子交換劑，結合磷酸基團(?PO3H2)和亞磷酸基團(?PO2H)為中等酸型離子交換劑，結合酚羥基(?OH )或羧基(?COOH)，如羧甲基(CM)為弱酸型離子交換劑。一般來講強酸型離子交換劑對H離子的結合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對H離子的結合力比Na+離子大。

陰離子交換劑的電荷基團帶正電，可以交換陰離子物質。同樣根據電荷基團的解離度不同，可以分為強堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結合季胺基團(?N(CH3)3)，如季胺乙基(QAE)為強堿型離子交換劑，結合叔胺(?N(CH3)2)、仲胺(?NHCH3)、伯胺(-NH2)等為中等或弱堿型離子交換劑，如結合二乙基氨基乙基(DEAE)為弱堿型離子交換劑。一般來講強堿型離子交換劑對OH?離子的結合力比Cl?離子小，弱酸型離子交換劑對OH?離子的結合力比Cl?離子大。

3. 交換容量

交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質有關。在實際實驗中關心的是層析柱與樣品中各個待分離組分進行交換時的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關，還與實驗條件有很大的關系，一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經說明都是指有效交換容量。

影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應盡量能夠讓樣品組分進入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因為小分子可以自由的進入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因為對于很大的分子，一般不能進入孔隙內部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。

另一些影響因素如實驗中的離子強度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質。一般pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對于弱酸型離子交換劑在pH較高時，電荷基團充分解離，交換容量大，而在較低的pH時，電荷基團不易解離，交換容量小。同時pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對于蛋白質等兩性物質，在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結合。一般來說，離子強度增大，交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫，就是要降低交換容量以將結合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。

離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數(meq / mg或meq / ml)來表示。通常可以由滴定法測定。陽離子交換劑首先用HCl處理，使其平衡離子為H?。再用水洗至中性，對于強酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出H?，再用標準濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計算出離子交換劑的交換容量;對于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H?充分置換出來，再用酸滴定，計算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。

對于一些常用于蛋白質分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質的量來表示，一般這種表示方法對于分離蛋白質等生物大分子具有更大的參考價值。實驗前可以參閱相應的產品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。

3.3.4 離子交換劑的選擇、處理和保存

1. 離子交換劑的選擇

離子交換劑的種類很多，離子交換層析要取得較好的效果首先要選擇合適的離子交換劑。

首先是對離子交換劑電荷基團的選擇，確定是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決于被分離的物質在其穩定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑;如帶負電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4，穩定的pH范圍為6-9，由于這時蛋白帶負電，故應選擇陰離子交換劑進行分離。強酸或強堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質失活，故一般分離蛋白質等大分子物質常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。

其次是對離子交換劑基質的選擇。前面已經介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用于分離小分子物質，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強，適合于分離蛋白質等大分子物質。一般纖維素離子交換劑價格較低，但分辨率和穩定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強度和pH變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩定性較好，分辨率也較高，但價格較貴。

另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(?m)來表示，目數越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關。一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢;顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。

這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素(二乙基氨基纖維素)和CM-纖維素(羧甲基纖維素)最常用，它們在生物大分子物質(蛋白質，酶，核酸等)的分離方面顯示很大的優越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網狀結構，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多;二是它具有親水性，對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。

2. 離子交換劑的處理和保存

離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去除雜質，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na型(即平衡離子是Na離子)，陰離子交換劑為Cl型，因為通常這樣比較穩定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5 mol / L，浸泡時間一般30 min。處理時應注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。

離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來性狀的過程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉型是指離子交換劑由一種平衡離子轉為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉為Cl型，用NaOH處理可轉為OH型，用甲酸鈉處理可轉為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。

前面已經介紹了，離子交換層析就是通過離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進行可逆的交換而實現分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結合力過強，會造成組分離子難以與交換劑結合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質時，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因為分離過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質的變性。

離子交換劑保存時應首先處理洗凈蛋白等雜質，并加入適當的防腐劑，一般加入0.02 %的疊氮鈉，4?C下保存。

3.3.5 離子交換層析的基本操作

離子交換層析的基本裝置及操作步驟與前面介紹的柱層析類似，這里就不再重復了。下面主要介紹離子交換層析操作中應注意的一些具體問題。

1. 層析柱

離子交換層析要根據分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。

2. 平衡緩沖液

離子交換層析的基本反應過程就是離子交換劑平衡離子與待分離物質、緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強度和pH的選擇對于分離效果有很大的影響。

平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質如蛋白質的穩定。其次是要使各個待分離物質與離子交換劑有適當的結合，并盡量使待分離樣品和雜質與離子交換劑的結合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩定的結合。而盡量使雜質不與離子交換劑結合或結合不穩定。在一些情況下(如污水處理)可以使雜質與離子交換劑有牢固的結合，而樣品與離子交換劑結合不穩定，也可以達到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結合力強的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，直接就可以去除大量的雜質。并使得后面的洗脫有很好的效果。如果平衡緩沖液選擇不合適，可能會對后面的洗脫帶來困難，無法得到好的分離效果。

3. 上樣

離子交換層析的上樣時應注意樣品液的離子強度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1-5%為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。

4. 洗脫緩沖液

在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交換劑結合的各個組分被洗脫下來;而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。梯度洗脫的裝置前面已經介紹了，可以有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進行洗脫。

洗脫液的選擇首先也是要保證在整個洗脫液梯度范圍內，所有待分離組分都是穩定的。其次是要使結合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內都能夠被洗脫下來。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。

5. 洗脫速度

洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時間長、樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個區域造成重疊，則應適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率;如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當提高洗脫速度。

6. 樣品的濃縮、脫鹽

離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進行濃縮、脫鹽處理。

3.3.6 離子交換層析的應用

離子交換層析的應用范圍很廣，主要有以下幾個方面。

1. 水處理

離子交換層析是一種簡單而有效的去除水中的雜質及各種離子的方法，聚苯乙烯樹脂廣泛的應用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾的方法，但要消耗大量的能源，而且制備量小、速度慢，也得不到高純度。用離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。一般是將水依次通過H? 型強陽離子交換劑，去除各種陽離子及與陽離子交換劑吸附的雜質;再通過OH? 型強陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質，即可得到純水。再通過弱型陽離子和陰離子交換劑進一步純化，就可以得到純度較高的純水。離子交換劑使用一段時間后可以通過再生處理重復使用。

2. 分離純化小分子物質

離子交換層析也廣泛的應用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質的分離純化。例如對氨基酸的分析，使用強酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH 2~3上柱。這時氨基酸都結合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的的離子強度和pH，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進行分離鑒定。目前已有全部自動的氨基酸分析儀。

3. 分離純化生物大分子物質

離子交換層析是依據物質的帶電性質的不同來進行分離純化的，是分離純化蛋白質等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品中蛋白的復雜性，一般很難只經過一次離子交換層析就達到高純度，往往要與其它分離方法配合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。

3.4 親和層析

3.4.1 簡介

親和層析(Affinity Chromatography)是利用生物分子間專一的親和力而進行分離的一種層析技術。人們很早就認識到蛋白質、酶等生物大分子物質能和某些相對應的分子專一而可逆的結合，可以用于對生物分子的分離純化。但由于技術上的限制，主要是沒有合適的固定配體的方法，所以在實驗中沒有廣泛的應用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝膠并偶聯蛋白質技術的出現，解決了配體固定化的問題，使得親和層析技術得到了快速的發展。親和層析是分離純化蛋白質、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應用。同時它也可以用于某些生物大分子結構和功能的研究。

3.4.2 親和層析的基本原理

生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉的抗原-抗體、酶-底物或抑制劑、激素-受體等等，它們之間都能夠專一而可逆的結合，這種結合力就稱為親和力。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質上的分子稱為配體，配體和基質是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質作為配體，例如分離酶可以選擇其底物類似物或競爭性抑制劑為配體，分離抗體可以選擇抗原作為配體等等。并將配體共價結合在適當的不溶性基質上，如常用的Sepharose-4B等。將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發生特異性的結合，從而留在固定相上;而其它雜質不能與配體結合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當的洗脫液將其從配體上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質。

前面介紹的一些層析方法，如吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等都是利用各種分子間的理化特性的差異，如分子的吸附性質、分子大小、分子的帶電性質等等進行分離。由于很多生物大分子之間的這種差異較小，所以這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物質通常需要多種方法結合使用，這不僅使分離需要較多的操作步驟、較長的時間，而且使待分離物的回收率降低，也會影響待分離物質的活性。親和層析是利用生物分子所具有的特異的生物學性質-親和力來進行分離純化的。由于親和力具有高度的專一性，使得親和層析的分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想的層析方法。

3.4.3 親和吸附劑

選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關鍵步驟之一。它包括基質和配體的選擇、基質的活化、配體與基質的偶聯等等。這里主要介紹一些基本的原理，關于活化、偶聯等過程的具體實驗操作可以參閱本書后面的實驗部分或相應的參考書。

1. 基質

⑴ 基質的性質

基質構成固定相的骨架，親和層析的基質應該具有以下一些性質：

1) 具有較好的物理化學穩定性。在與配體偶聯、層析過程中配體與待分離物結合、以及洗脫時的pH、離子強度等條件下，基質的性質都沒有明顯的改變。

2) 能夠和配體穩定的結合。親和層析的基質應具有較多的化學活性基團，通過一定的化學處理能夠與配體穩定的共價結合，并且結合后不改變基質和配體的基本性質。

3) 基質的結構應是均勻的多孔網狀結構。以使被分離的生物分子能夠均勻、穩定的通透，并充分與配體結合。基質的孔徑過小會增加基質的排阻效應，使被分離物與配體結合的機率下降，降低親和層析的吸附容量。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質，以使待分離物有充分的空間與配體結合。

4) 基質本身與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結合。基質應具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。

一般纖維素以及交聯葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質，其中以瓊脂糖凝膠應用最為廣泛。纖維素價格低，可利用的活性基團較多，但它對蛋白質等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用，另外它的穩定性和均一性也較差。交聯葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學穩定性較好，但它們的孔徑相對比較小，而且孔徑的穩定性不好，可能會在與配體偶聯時有較大的降低，不利待分離物與配體充分結合，只有大孔徑型號凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點是機械強度好，化學穩定性好。但它可利用的活性基團較少，對蛋白質等生物分子也有較強的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個條件，它具有非特異性吸附低、穩定性好、孔徑均勻適當、宜于活化等優點，因此得到了廣泛的應用，如Pharmacia公司的Sepharose-4B、6B是目前應用較多的基質。

⑵ 基質的活化

基質的活化是指通過對基質進行一定的化學處理，使基質表面上的一些化學基團轉變為易于和特定配體結合的活性基團。配體和基質的偶聯，通常首先要進行基質的活化。

1) 多糖基質的活化

前面已經介紹了，多糖基質尤其是瓊脂糖是一種常用的基質。瓊脂糖通常含有大量的羥基，通過一定的處理可以引入各種適宜的活性基團。瓊脂糖的活化方法很多，下面介紹一些常用的活性基團及活化方法。

① 溴化氰活化

溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨基(NH2)反應，主要生成異脲衍生物。

溴化氰活化的基質可以在溫和的條件下與配體結合，結合的配體量大。利用溴化氰活化的基質通過進一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質和配體偶聯后生成的異脲衍生物中氨基的pKa=10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質與配體結合不夠穩定，尤其是當與小配體結合時，可能會出現配體脫落現象。另外溴化氰有劇毒、易揮發，所以操作不便。通過實驗條件的不斷改進，這些缺點可以得到一定程度的控制。

②環氧乙烷基活化

這類方法活化后的基質都含有環氧乙烷基。如在含有NaBH4的堿性條件下，1，4-丁二醇-雙縮水甘油醚的一個環氧乙烷基可以與羥基反應，而將另一個環氧乙烷基結合在基質上。另外也可以用環氧氯丙烷活化，將環氧乙烷基結合在基質上。

這種活化方法的優點是活化后不引入電荷基團，而且基質與配體形成的N-C、O-C和S-C鍵都很穩定，所以配體與基質結合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點是用環氧乙基活化的基質在與配體偶聯時需要堿性條件，pH為9~13，溫度為

20~40 ?C。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。

上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有很多種活化方法如：N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化、三嗪(triazine)活化、高碘酸鹽(periodate)活化、羰酰二咪唑(carbonyldiimidazole)活化、2,4,6-三氟5-氯吡啶(FCP)活化、乙二酸酰肼(adipic acid dihydrazide)活化、二乙烯砜(divinylsulfone)活化等，總之，目前對基質的活化方法很多，各有其特點，應根據實際需要選擇適當的活化方法。

2) 聚丙烯酰胺的活化

聚丙烯酰胺凝膠有大量的甲酰胺基，可以通過對甲酰胺基的修飾而對聚丙烯酰胺凝膠進行活化。一般有以下三種方式：氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。另外在偶聯蛋白質配體時也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝膠。

3) 多孔玻璃珠的活化

對于多孔玻璃珠等無機凝膠的活化通常采用硅烷化試劑與玻璃反應生成烷基胺-玻璃，在多孔玻璃上引進氨基，再通過這些氨基進一步反應引入活性基團，與適當的配體偶聯。

⑶間隔臂分子

在親和層析中，由于配體結合在基質上，它在與待分離的生物大分子結合時，很大程度上要受到基質和待分離的生物大分子間的空間位阻效應的影響。尤其是當配體較小或待分離的生物大分子較大時，由于直接結合在基質上的小分子配體非常靠近基質，而待分離的生物大分子由于受到基質的空間障礙，使得其與配體結合的部位無法接近配體，影響了待分離的生物大分子與配體的結合，造成吸附量的降低。解決這一問題的方法通常是在配體和基質之間引入適當長度的“間隔臂”，即加入一段有機分子，使基質上的配體離開基質的骨架向外擴展伸長，這樣就可以減少空間位阻效應，大大增加配體對待分離的生物大分子的吸附效率。加入手臂的長度要恰當，太短則效果不明顯;太長則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。

引入間隔臂分子常用的方法是將適當長度的氨基化合物NH2 (CH2)n R共價結合到活化的基質上，R通常是氨基或羧基，n一般為2-12。例如Pharmacia公司生產的AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B就是分別將1,6-乙二胺，6-氨基乙酸與CNBr活化的瓊脂糖反應引入間隔臂分子。二者的末端分別為氨基或羧基，通過碳二亞胺的縮合作用可以分別與含羧基或氨基的配體偶聯。

另外也可以通過進一步的活化處理，生成N-羥基琥珀酰亞胺酯、環氧基等活性基團直接與各種配體偶聯。引入間隔臂的基質與配體結合時，配體就可以離開基質一定的空間，從而可以減少空間位阻效應，易于與待分離物質結合。

2. 配體

⑴ 配體的性質

親和層析是利用配體和待分離物質的親和力而進行分離純化的，所以選擇合適的配體對于親和層析的分離效果是非常重要的。理想的配體應具有以下一些性質：

1) 配體與待分離的物質有適當的親和力。親和力太弱，待分離物質不易與配體結合，造成親和層析吸附效率很低。而且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但如果親和力太強，待分離物質很難與配體分離，這又會造成洗脫的困難。總之，配體和待分離物質的親和力過弱或過強都不利于親和層析的分離。應根據實驗要求盡量選擇與待分離物質具有適當的親和力的配體。

2) 配體與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性，也就是說配體與待分離物質有適當的親和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。

3) 配體要能夠與基質穩定的共價結合，在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質偶聯后，對其結構沒有明顯改變，尤其是偶聯過程不涉及配體中與待分離物質有親和力的部分，對二者的結合沒有明顯影響。

4) 配體自身應具有較好的穩定性，在實驗中能夠耐受偶聯以及洗脫時可能的的較劇烈的條件，可以多次重復使用。

完全滿足上述條件的配體實際上很難找到，在實驗中應根據具體的條件來選擇盡量滿足上述條件的最適宜的配體。

根據配體對待分離物質的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體(specific ligand)和通用性配體(general ligand)。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素-受體等，它們結合都具有很高的特異性，用這些物質作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗。解決這一問題的方法是使用通用性的配體。通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體，如各種凝集素(lectine)可以結合各種糖蛋白，核酸可以結合RNA、結合RNA的蛋白質等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結構穩定、偶聯率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優點，所以在實驗中得到了廣泛的應用。在后面的親和層析應用中將詳細介紹實驗中各種常用的配體。

⑵ 配體與基質的偶聯

除了前面已經介紹了基質的一些活化基團外，通過對活化基質的進一步處理，還可以得到更多種類的活性基團。這些活性基團可以在較溫和的條件下與含氨基、羧基醛基、酮基、羥基、硫醇基等多種配體反應，使配體偶聯在基質上。另外通過碳二亞胺、戊二醛等雙功能試劑的作用也可以使配體與基質偶聯。以上這些方法使得幾乎任何一種配體都可以找到適當的方法與基質偶聯。關于配體和基質偶聯的具體實驗操作可以參閱本書后面的實驗部分或相應的參考文獻。

配體和基質偶聯完畢后，必須要反復洗滌，以去除未偶聯的配體。另外要用適當的方法封閉基質中未偶聯上配體的活性基團，也就是使基質失活，以免影響后面的親和層析分離。例如對于能結合氨基的活性基團，常用的方法是用2-乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。

配體與基質偶聯后，通常要測定配體的結合量以了解其與基質的偶聯情況，同時也可以推斷親和層析過程中對待分離的生物大分子吸附容量。配體結合量通常是用每毫升或每克基質結合的配體的量來表示。測定配體結合量的方法很多，下面簡單介紹幾種：

1) 差量分析：根據加入配體的總量減去配體與基質偶聯后洗滌出來的量即可大致推算出配體的結合量。當配體可以用光譜法準確定量時，這種方法還是相當準確的。

2) 直接光譜測量：對于能夠吸收250nm以上波長的配體，可以直接用光譜法測定與基質結合的配體的量。

3) 凝膠溶解：通過適當的方法將凝膠溶解，如75?C下與酸或堿作用，而后直接用光譜法測量。

4) 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基質釋放出配體或配體的裂解物進行分析。

5) 2,4,6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)分析：利用TNBS與未結合配體和結合某些配體的基質作用呈現不同的顏色，可以計算出配體結合量

6) 元素分析：如果配體中含有某種特別的元素，通過元素分析就可以確定配體結合量。

7) 放射性分析法：偶聯中加入一定量帶有同位素的配體，通過放射性分析確定配體結合量，這是一種非常靈敏的方法。

影響配體結合量的因素很多，包括基質和配體的性質、基質的活化方法及條件、基質和配體偶聯反應的條件等等。例如通常溴化氰活化的基質的活性基團比環氧基活化的基質多，配體結合量可能較大。在用溴化氰活化時，增加溴化氰的量及反應的pH，可以增加基質上活化基團的量，從而增大配體結合量。偶聯過程中增加配體的量及增大反應的pH，也可以增大配體結合量。實驗中通常希望配體結合量較高，但應注意增加配體結合量應根據實際情況，還要考慮到其它因素的影響。因為提高配體的結合量不等價于提高親和吸附劑的吸附容量，配體結合量只是影響親和吸附劑吸附容量的一個因素，還有很多因素，如基質、配體以及待分離物質本身的性質，配體在基質的結合情況以及后面要介紹的實驗操作條件等都可能對親和吸附劑的吸附容量產生很大的影響。例如增大配體的結合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配體結合量的條件可能會影響配體的結構，降低配體和待分離物質的親和力，這樣反而會降低親和吸附劑的吸附容量。實際影響親和吸附劑吸附容量的因素是非常復雜的，各種因素的影響都不是絕對的，要獲得較高的吸附容量往往要考慮很多因素，并通過實驗摸索來選擇合適的條件。

目前已有多種活化的基質以及偶聯各種配體的親和吸附劑制成商品出售，可以省去基質活化，配體偶聯等復雜的步驟。使用方便，效果好，但一般價格昂貴。關于這些產品的具體情況，可參閱本書后面的參考文獻或相關的產品介紹。

3. 親和吸附劑的再生和保存

親和吸附劑的再生就是指使用過的親和吸附劑，通過適當的方法使去除吸附在其基質和配體(主要是配體)上結合的雜質，使親和吸附劑恢復親和吸附能力。一般情況下，使用過的親和層析柱，用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情況下，尤其是當待分離樣品組分比較復雜的時候，親和吸附劑可能會產生較嚴重的不可逆吸附，使親和吸附劑的吸附效率明顯下降。這時需要使用一些比較強烈的處理手段，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當的非專一性蛋白酶。但如果配體是蛋白質等一些易于變性的物質，則應注意處理時不能改變配體的活性。

親和吸附劑的保存一般是加入0.01%的疊氮化鈉，4?C下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。應注意不要使親和吸附劑冰凍。

3.4.4 親和層析的基本操作

親和吸附劑選擇制備后，親和層析的其它操作與一般的柱層析基本類似。下面主要介紹親和層析過程中的一些注意事項。

1. 上樣

親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時應注意選擇適當的條件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強度、溫度等，以使待分離的物質能夠充分結合在親和吸附劑上。

一般生物大分子和配體之間達到平衡的速度很慢，所以樣品液的濃度不易過高，上樣時流速應比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時間進行吸附。特別是當配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質較多時，可以在上樣后停止流動，讓樣品在層析柱中反應一段時間，或者將上樣后流出液進行二次上樣，以增加吸附量。樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強度，以減小基質、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。

生物分子間的親和力是受溫度影響的，通常親和力隨溫度的升高而下降。所以在上樣時可以選擇適當較低的溫度，使待分離的物質與配體有較大的親和力，能夠充分的結合;而在后面的洗脫過程可以選擇適當較高的溫度，使待分離的物質與配體的親和力下降，以便于將待分離的物質從配體上洗脫下來。

上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質。平衡緩沖液的流速可以快一些，但如果待分離物質與配體結合較弱，平衡緩沖液的流速還是較慢為宜。如果存在較強的非特異性吸附，可以用適當較高離子強度的平衡緩沖液進行洗滌，但應注意平衡緩沖液不應對待分離物質與配體的結合有明顯影響，以免將待分離物質同時洗下。

2. 洗脫

親和層析的另一個重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫。

⑴ 特異性洗脫

特異性洗脫是指利用洗脫液中的物質與待分離物質或與配體的親和特性而將待分離物質從親和吸附劑上洗脫下來。

特異性洗脫也可以分為兩種：一種是選擇與配體有親和力的物質進行洗脫，另一種是選擇與待分離物質有親和力的物質進行洗脫。前者在洗脫時，選擇一種和配體親和力較強的物質加入洗脫液，這種物質與待分離物質競爭對配體的結合，在適當的條件下，如這種物質與配體的親和力強或濃度較大，配體就會基本被這種物質占據，原來與配體結合的待分離物質被取代而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時，可以用適當的單糖洗脫，單糖與糖蛋白競爭對凝集素的結合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來。后一種方法洗脫時，選擇一種與待分離物質有較強親和力的物質加入洗脫液，這種物質與配體競爭對待分離物質的結合，在在適當的條件下，如這種物質與待分離物質的親和力強或濃度較大，待分離物質就會基本被這種物質結合而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用染料作為配體分離脫氫酶時，可以選擇NAD+進行洗脫，NAD+是脫氫酶的輔酶，它與脫氫酶的親和力要強于染料，所以脫氫酶就會與NAD+結合而從配體上脫離。特異性洗脫方法的優點是特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。另外對于待分離物質與配體親和力很強的情況，使用非特異性洗脫方法需要較強烈的洗脫條件，很可能使蛋白質等生物大分子變性，有時甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來，使用特異性洗脫則可以避免這種情況。由于親和吸附達到平衡比較慢，所以特異性洗脫往往需要較常的時間和較大的洗脫條件，可以通過適當的改變其它條件，如選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度等等，來縮小洗脫時間和洗脫體積。

⑵ 非特異性洗脫

非特異性洗脫是指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度、溫度等條件，降低待分離物質與配體的親和力而將待分離物質洗脫下來。

當待分離物質與配體親和力較小時，一般通過連續大體積平衡緩沖液沖洗，就可以在雜質之后將待分離物質洗脫下來，這種洗脫方式簡單、條件溫和，不會影響待分離物質的活性。但洗脫體積一般比較大，得到的待分離物質濃度較低。當待分離物質和配體結合較強時，可以通過選擇適當的pH、離子強度等條件降低待分離物質與配體的親和力，具體的條件需要在實驗中摸索。可以選擇梯度洗脫方式，這樣可能將親和力不同的物質分開。如果希望得到較高濃度的待分離物質，可以選擇酸性或堿性洗脫液，或較高的離子強度一次快速洗脫，這樣在較小的洗脫體積內就能將待分離物質洗脫出來。但選擇洗脫液的pH、離子強度時應注意盡量不影響待分離物質的活性，而且洗脫后應注意中和酸堿，透析去除離子，以免待分離物質喪失活性。對于待分離物質與配體結合非常牢固時，可以使用較強的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑使蛋白質等待分離物質變性，而從配體上解離出來。然后再通過適當的方法使待分離物質恢復活性。

3.4.5 親和層析的應用

親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。下面簡單介紹一些親和層析技術用于純化各種生物大分子的情況。

1. 抗原和抗體

利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合于親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低，用離子交換、凝膠過濾等方法都難于進行分離，而親和層析則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫后制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。抗原、抗體間親和力一般比較強，其解離常數為10 ?8-10 ?12M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強烈的洗脫條件。可以采取適當的方法如改變抗原、抗體種類或使用類似物等來降低二者的親和力，以便于洗脫。

另外金黃色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能夠與免疫球蛋白G(Ig G)結合，可以用于分離各種Ig G。

2. 生物素和親和素

生物素(biotion)和親和素(avidin)之間具有很強而特異的親和力，可以用于親和層析。如用親和素分離含有生物素的蛋白等。生物素和親和素的親和力很強，其解離常數為10 ?15M，洗脫通常需要強類的變性條件，可以選擇biotion的類似物，如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低與avidin的親和力，這樣可以在較溫和的條件下將其從avidin上洗脫下來。另外，可以利用生物素和親和素間的高親和力，將某種配體固定在基質上。例如將生物素酰化的胰島素與以親和素為配體的瓊脂糖作用，通過生物素與親和素的親和力，胰島素就被固定在瓊脂糖上，可以用于親和層析分離與胰島素有親和力的生物大分子物質。這種非共價的間接結合比直接將胰島素共價結合與CNBr活化的瓊脂糖上更穩定。很多種生物大分子可以用生物素標記試劑(如生物素與NHS生成的酯)作用結合上生物素，并且不改變其生物活性，這使得生物素和親和素在親和層析分離中有更廣泛的用途。

3. 維生素、激素和結合轉運蛋白

通常結合蛋白含量很低，如1000升人血漿中只含有20毫克Vit B12結合蛋白，用通常的層析技術難于分離。利用維生素或激素與其結合蛋白具有強而特異的親和力(解離常數為10 ?7-10 ?16M)而進行親和層析則可以獲得較好的分離效果。由于親和力較強，所以洗脫時可能需要較強烈的條件，另外可以加入適量的配體進行特異性洗脫。

4. 激素和受體蛋白

激素的受體蛋白屬于膜蛋白，利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質，難于用通常的層析技術分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對應激素的結合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力(10 ?6-10 ?12M)而進行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白，如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。

5. 凝集素和糖蛋白

凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。如伴刀豆球蛋白A能結合含?-D-吡喃甘露糖苷或?-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經氨酸結合，可以用于血型糖蛋白A、紅細胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時只需用相應的單糖或類似物，就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來。如洗脫伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用?-D-甲基甘露糖苷或?-D-甲基葡萄糖苷洗脫。同樣，用適當的糖蛋白或單糖、多糖作為配體也可以分離各種凝集素。

6. 輔酶

核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應酶的親和力可以對多種酶類進行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應用很廣泛，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。

7. 多核苷酸和核酸

利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結合蛋白。poly-A可以用于分離各種RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A結合蛋白。以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。

8. 氨基酸

固定化氨基酸是多用途的介質，通過氨基酸與其互補蛋白間的親和力，或者通過氨基酸的疏水性等性質，可以用于多種蛋白質、酶的分離純化。例如L-精氨酸可以用于分離羧肽酶，L-賴氨酸則廣泛的應用于分離各種rRNA。

9. 染料配體

結合在藍色葡聚糖中的藍色染料Cibacron Blue F3GA是一種多芳香環的磺化物。由于它具有與NAD+相似的空間結構，所以它與各種激酶、脫氫酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有親和力，可以用于親和層析分離。另外較常用的還有Procion Red HE3B等。染料作為配體吸附容量高、可以多次重復使用。但它有一定的陽離子交換作用，使用時應適當提高緩沖液離子強度來減少非特異性吸附。

10. 分離病毒、細胞

利用配體與病毒、細胞表面受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細胞的分離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細胞的分離。例如各種凝集素可以用于分離紅細胞以及各種淋巴細胞，胰島素可以用于分離脂肪細胞等。由于細胞體積大、非特異性吸附強，所以親和層析時要注意選擇合適的基質。目前已有特別的基質如Pharmacia公司生產的Sepharose 6MB，顆粒大、非特異性吸附小，適合用于細胞親和層析。

11. 金屬螯合色譜

金屬螯合色譜以及后面介紹的共價色譜、疏水色譜是一些特殊的親和層析技術。金屬螯合色譜通常使用亞氨二乙酸(IDA)等螯合劑，它能與Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用，生成帶有多個配位基的金屬螯合物，可以用于生物分子尤其是對重金屬有較強親和力的蛋白質的分離純化。例如Cu2+-IDA配體可以用于分離帶精氨酸的蛋白質。

12. 共價色譜

共價色譜與常規的親和色譜方法不同之處在于它是利用親和吸附劑與待分離的蛋白質的共價結合而將其吸附，而后用適當的處理方法將共價鍵打開而將蛋白釋放出來。例如活化的巰基-Sepharose、巰丙基-Sepharose等活化基質可以直接與含巰基的蛋白質通過二硫鍵共價結合而將其吸附在基質上，通過適當的洗脫液如半胱氨酸，巰基乙醇等還原二硫鍵即可將蛋白質洗脫下來。共價色譜結合和洗脫條件一般都很溫和，可以多次重復使用。

13. 疏水色譜

疏水色譜是指利用固定的疏水配體和蛋白質疏水表面區域之間的相互作用而進行分離的。例如用各種烷胺作為配體與基質結合，用于分離糖元磷酸化酶b等。