生化實驗講義(理論部分)三－－層析技術（一）

3.1 層析技術概述

3.1.1 引言

層析法又稱色層分析法或色譜法(Chromatography)，它是在1903-1906年由俄國植物學家M. Tswett首先系統提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同顏色的譜帶或稱色譜圖(Chromatogram)。

當時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應用到分離復雜的有機混合物，人們才發現了它的廣泛用途。

隨著科學技術的發展以及生產實踐的需要，層析技術也得到了迅速的發展。為此作出重要貢獻的當推英國生物學家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數基礎上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據液-液逆流萃取的原理，發明了液-液分配色譜。特別是他們提出了遠見卓識的預言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質間的作用力減小了，這對分離更有好處;二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數)，這將會大大提高分離效率。前者預見了氣相色譜的產生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革;后者預見了高效液相色譜(HPLC)的產生，在60年代末也為人們所實現，現在HPLC已成為生物化學與分子生物學、化學等領域不可缺少的分析分離工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予諾貝爾化學獎。如今的色層分析法經常用于分離無色的物質，已沒有顏色這個特殊的含義。但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用。現在我們簡稱為層析法或層析技術。

層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用于少量物質的分析鑒定，又可用于大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用于科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫藥衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。

3.1.2 層析的基本理論

層析法是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(或稱分配常數)不同，達到彼此分離的目的。

對于一個層析柱來說，可作如下基本假設：

1. 層析柱的內徑和柱內的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據，一部分為流動相占據，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm表示。

2. 每個塔板內溶質分子在固定相與流動相之間瞬間達到平衡，且忽略分子縱向擴散。

3. 溶質在各塔板上的分配系數是一常數，與溶質在塔板的量無關。

4. 流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程(即不連續過程)。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當流過層析柱的流動相的體積為V時，則流動相在每個塔板上跳越的次數為n:

n =

5. 溶質開始加在層析柱的第零塔板上。根據以上假定，將連續的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當于一個兩相平衡的小單元。

3.1.3 層析的基本概念

1. 固定相：

固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質(如吸附劑，凝膠，離子交換劑等)，也可以是液體物質(如固定在硅膠或纖維素上的溶液)，這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關鍵的作用。

2. 流動相：

在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。

3. 分配系數及遷移率(或比移值)：

分配系數是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量(濃度)的比值，常用K來表示。分配系數是層析中分離純化物質的主要依據。

K=Cs/Cm

其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度。

遷移率(或比移值)是指：在一定條件下，在相同的時間內某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。

實驗中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。不同物質的分配系數或遷移率是不同的。分配系數或遷移率的差異程度是決定幾種物質采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。

分配系數主要與下列因素有關：①被分離物質本身的性質;②固定相和流動相的性質;③層析柱的溫度。對于溫度的影響有下列關系式：

lnK = -(?G0/RT)

式中： K為分配系數(或平衡常數)

?G0為標準自由能變化

R為氣體常數

T為絕對溫度

這是層析分離的熱力學基礎。一般情況下，層析時組分的?G0為負值，則溫度與分配系數成反比關系。通常溫度上升20?C, K值下降一半，它將導致組分移動速率增加。這也是為什么在層析時最好采用恒溫柱的原因。有時對于K值相近的不同物質，可通過改變溫度的方法，增大K值之間的差異，達到分離的目的。

4. 分辨率(或分離度)

分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度。用Rs來表示。Rs值越大，兩種組分分離的越好。當Rs = 1時，兩組分具有教好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，尤其要求較高的分辨率。

為了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：

⑴ 使理論塔板數N增大，則Rs上升。

① 增加柱長，N可增大，可提高分離度，但它造成分離的時間加長，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。

② 減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實際應用。一般液相層析的固定相顆粒為100?m;而HPLC柱子的固定相顆粒為10?m以下，且壓力可達150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分離的效率大大提高了。

③ 采用適當的流速，也可使理論塔板的高度降低，增大理論塔板數。太高或太低的流速都是不可取的。對于一個層析柱，它有一個最佳的流速。特別是對于氣相色譜，流速影響相當大。

⑵ 改變容量因子D(固定相與流動相中溶質量的分布比)。一般是加大D，但D的數值通常不超過10，再大對提高Rs不明顯，反而使洗脫的時間延長，譜帶加寬。一般D限制在1 ? D ? 10，最佳范圍在1.5-5之間。我們可以通過改變柱溫(一般降低溫度)，改變流動相的性質及組成(如改變pH值，離子強度，鹽濃度，有機溶劑比例等)，或改變固定相體積與流動相體積之比(如用細顆粒固定相，填充的緊密與均勻些)，提高D值，使分離度增大。

⑶ 增大?(分離因子，也稱選擇性因子，是兩組分容量因子D之比)，使Rs變大。實際上，使 ? 增大，就是使兩種組分的分配系數差值增大。同樣，我們可以通過改變固定相的性質、組成，改變流動相的性質、組成，或者改變層析的溫度，使 ? 發生改變。應當指出的是，溫度對分辨率的影響，是對分離因子與理論塔板高度的綜合效應。因為溫度升高，理論塔板高度有時會降低，有時會升高，這要根據實際情況去選擇。通常，? 的變化對Rs影響最明顯。

總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方面的。我們應當根據實際情況綜合考慮，特別是對于生物大分子，我們還必須考慮它的穩定性，活性等問題。如pH值、溫度等都會產生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預期的效果。

5. 正相色譜與反相色譜

正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。

反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。

一般來說，分離純化極性大的分子(帶電離子等)采用正相色譜(或正相柱)，而分離純化極性小的有機分子(有機酸、醇、酚等)多采用反相色譜(或反相柱)。

6. 操作容量(或交換容量)

在一定條件下，某種組分與基質(固定相)反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量，我們稱為操作容量(或交換容量)。它的單位是毫摩爾(或毫克)/克(基質)或毫摩爾(或毫克)/毫升(基質)，數值越大，表明基質對該物質的親合力越強。應當注意，同一種基質對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大小(空間效應)、帶電荷的多少、溶劑的性質等多種因素的影響。因此，實際操作時，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。

3.1.4 層析法的分類

層析根據不同的標準可以分為多種類型:

1. 根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質的層析。薄層層析是將基質在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進行層析。柱層析則是指將基質填裝在管中形成柱形，在柱中進行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。

2. 根據流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限制了其在生化領域的應用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。

3. 根據分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。

吸附層析是以吸附劑為固定相，根據待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術。

分配層析是根據在一個有兩相同時存在的溶劑系統中，不同物質的分配系數不同而達到分離目的的一種層析技術。

凝膠過濾層析是以具有網狀結構的凝膠顆粒作為固定相，根據物質的分子大小進行分離的一種層析技術。

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據物質的帶電性質不同而進行分離的一種層析技術。

親和層析是根據生物大分子和配體之間的特異性親和力(如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等)，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結合的生物大分子進行分離的一種層析技術。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術，具有很高分辨率。

3.1.5 柱層析的基本裝置及基本操作

目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細討論。

1. 柱層析的基本裝置

2. 柱層析的基本操作

柱層析的基本操作包括以下一些步驟：

⑴ 裝柱

柱子裝的質量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質的關鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。

首先選好柱子，根據層析的基質和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50;凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。

將層析用的基質(如吸附劑、樹脂、凝膠等)在適當的溶劑或緩沖液中溶脹，并用適當濃度的酸(0.5N~1N)、堿 (0.5N~1N)、鹽(0.5M~1M)溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質。然后用去離子水(或蒸餾水)洗滌干凈并真空抽氣(吸附劑等與溶液混合在一起)，以除去其內部的氣泡。

關閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。

打開出水口，控制適當流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。(吸附劑的多少根據分離樣品的多少而定。)注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。

最后使柱中基質表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關閉出水口。(采用機械化裝柱法在此省略。)

⑵ 平衡

柱子裝好后，要用所需的緩沖液(有一定的pH和離子強度)平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子(平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同)。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩定及基質充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進行轉型處理。這方面的內容在離子交換層析中加以介紹。

⑶ 加樣

加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。

應注意的是，加樣時應緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質，以保持基質表面平坦。詳細操作見層析實驗。

⑷ 洗脫

當我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。

簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結束為止。如果被分離物質對固定相的親合力差異不大，其區帶的洗脫時間間隔(或洗脫體積間隔)也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數較大。否則應采用下面的方法。

分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。

梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強度梯度。可形成梯度的形式有三種。

洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當對所分離的混合物的性質了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質相近的組分分離更為有利。同時還應注意洗脫時的速率。前面我們已經談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質的擴散，同樣達不到理想的分離效果。只有多次試驗才會得到合適的流速。總之，我們必須經過反復的試驗與調整(可以用正交試驗或優選法)，才能得到最佳的洗脫條件。還應強調的一點是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。

⑸ 收集、鑒定及保存

在生化實驗中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質性質很相近，可低至0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進行鑒定。對于是單條帶的，認為已達電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質采用相應的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產品的穩定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存備用。

⑹ 基質(吸附劑、交換樹脂或凝膠等)的再生

許多基質(吸附劑、交換樹脂或凝膠等)可以反復使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴禁亂倒亂扔。這也是一個科研工作者的科學作風問題。各種基質的再生方法可參閱具體層析實驗及有關文獻。

3.2 凝膠層析

3.2.1 簡介

凝膠層析(gel chromatography)又稱為凝膠排阻層析(gel exclusion chromatography)、分子篩層析(molecular sieve chromatography)、凝膠過濾(gel filtration)、凝膠滲透層析(gel permeation chromatography)等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物-交聯葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯聚苯乙烯凝膠，能夠進行有機溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析(流動相為有機溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析)。隨后這一技術得到不斷的完善和發展，目前廣泛的應用于生物化學、高分子化學等很多領域。

凝膠層析是生物化學中一種常用的分離手段，它具有設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、特別是不改變樣品生物學活性等優點，因此廣泛用于蛋白質(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應用于蛋白質分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。

3.2.2 凝膠層析的基本原理

凝膠層析是依據分子大小這一物理性質進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以首先流出;而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，經歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出;而分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。

1. 外水體積、內水體積、基質體積、柱床體積、洗脫體積

外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內水體積。基質體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內水體積為Vi，基質體積為Vg，則有：

Vt=Vo+Vi+Vg

由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：

Vt=Vo+Vi

設洗脫體積為Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。對于完全排阻的大分子，由于其不進入凝膠顆粒內部，而只存在于流動相中，故其洗脫體積Ve=Vo;對于完全滲透的小分子，由于它可以存在于凝膠柱整個體積內(忽略凝膠本身體積Vg)，故其洗脫體積Ve=Vt。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。有時可能會出現Ve ? Vt，這是由于這種分子與凝膠有吸附作用造成的。

柱床體積Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預定標記處，然后測量水的體積來測定。外水體積Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質的洗脫體積來測定，一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質。因為它的分子量大(為200萬)，在各種型號的凝膠中都被排阻，并且它呈藍色，易于觀察和檢測。

2. 分配系數

分配系數是指某個組分在固定相和流動相中的濃度比。對于凝膠層析，分配系數實質上表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。

3. 排阻極限

排阻極限是指不能進入凝膠顆粒孔穴內部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如Sephadex G-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。

4. 分級分離范圍

分級分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對于分子量在這個范圍內的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如Sephadex G-75對球形蛋白的分級分離范圍為3,000-70,000，它表示分子量在這個范圍內的球形蛋白可以通過Sephadex G-75得到較好的分離。應注意，對于同一型號的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級分離范圍是不同的。

5. 吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。而床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。

6. 凝膠顆粒大小

層析用的凝膠一般都成球形，顆粒的大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(m)來表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關。顆粒大，流速快，但分離效果差;顆粒小，分離效果較好，但流速慢。一般比較常用的是100-200目。

3.2.4 凝膠的種類和性質

凝膠的種類很多，常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠(dextran)、聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide)、瓊脂糖凝膠(agarose)以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯物。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等。下面將分別介紹。

1. 葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠是指由天然高分子-葡聚糖與其它交聯劑交聯而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech生產。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。

葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列，它是葡聚糖與3-氯-1,2環氧丙烷(交聯劑)相互交聯而成，交聯度由環氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號是G-10 ? G-200，后面的數字是凝膠的吸水率(單位是ml / g干膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干膠。Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。Sephadex中排阻極限最大的G-200為6?105。Sephadex在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩定的，可以多次重復使用。Sephadex穩定工作的pH一般為為2-10。強酸溶液和氧化劑會使交聯的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex與強酸和氧化劑接觸。Sephadex在高溫下穩定，可以煮沸消毒，在100 ?C下40 min對凝膠的結構和性能都沒有明顯的影響。Sephadex由于含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(尤其是堿性蛋白)發生吸附作用。但一般在離子強度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex與蛋白發生吸附，但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發生較大的變化。Sephadex有各種顆粒大小(一般有粗、中、細、超細)可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差;細顆粒流速慢，但分辨率高。要根據分離要求來選擇顆粒大小。Sephadex的機械穩定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現快速而高效的分離。

另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應，形成LH型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機溶劑為流動相，分離脂溶性物質，例如膽固醇、脂肪酸激素等。

Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺(N, N’-methylenebisacrylamide)交聯而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。Sephacryl的優點就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達到108，遠遠大于Sephadex的范圍。所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質粒、甚至較大的病毒顆粒。 Sephacryl與Sephadex相比另一個優點就是它的化學和機械穩定性更高：Sephacryl在各種溶劑中很少發生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl穩定工作的pH一般為

3~11。另外Sephacryl的機械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl相比Sephadex可以實現相對比較快速而且較高分辨率的分離。

2. 聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺(acrylamide)與甲叉雙丙烯酰胺交聯而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯度的產物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-Rad Laboratories生產，商品名為Bio-Gel P，主要型號有Bio-Gel P-2 ? Bio-Gel P-300等10種，后面的數字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數字越大，可分離的分子量也就越大。各種型號的主要參數如附表所示。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-Gel P-300為4?105。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中都比較穩定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩定性較好，在pH為1~10之間比較穩定。但在較強的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發生分解。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，所以吸附效應較小。另外，聚丙烯酰胺凝膠不會象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強度略高的洗脫液就可以避免。

3. 瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖是由D-半乳糖(D-galactose)和3,6-脫水半乳糖(anhydrogalactose)交替構成的多糖鏈。它在100 ?C時呈液態，當溫度降至45 ?C以下時，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環的瓊脂糖，經凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的商品名因生產廠家不同而異，常見的主要有Pharmacia Biotech生產的Sepharose(2B ? 4B)和Bio-Rad Laboratories生產的Bio-gel A等。關于各種瓊脂糖凝膠的基本參數如附表所示。瓊脂糖凝膠在pH為4-9之間是穩定的，它在室溫下很穩定，穩定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小。另外瓊脂糖凝膠的機械強度和孔穴的穩定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時洗脫速度可以比較快。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0-30 ?C為宜。

Sepharose與2,3二溴丙醇反應，形成Sepharose CL型凝膠(CL-2B ? CL-4B)，它們的分離特性基本沒有改變，但熱穩定性和化學穩定性都有所提高，可以在更廣泛的pH范圍內應用，穩定工作的pH范圍為3-13。Sepharose CL型凝膠還特別適合于含有有機溶劑的分離。

4. 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯凝膠

這類凝膠是由交聯的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內部的瓊脂糖組成。它們主要由LKB提供，商品名為Ultragel。這種凝膠由于含有聚丙烯酰胺，所以有較高分辨率;而它又含有瓊脂糖，這使得它又有較高的機械穩定性，可以使用較高的洗脫速度。調整聚丙烯酰胺和瓊脂糖的濃度可以使Ultragel有不同的分離范圍，

5. 多孔硅膠、多孔玻璃珠

多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于無機凝膠。顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網孔狀結構的球形顆粒。這類凝膠屬于硬質無機凝膠，它們的最大的特點是機械強度很高、化學穩定性好，使用方便而且壽命長，無機膠一般柱效較低，但用微粒的多孔硅膠制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以達到4?104塔板 / 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填裝緊密，所以柱效相對較低。多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為102-5?106，多孔玻璃珠一般為3?103-9?106。它們的最大缺點是吸附效應較強(尤其是多孔硅膠)，可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。另外它們也不能用于強堿性溶液，一般使用時pH應小于8.5。

另外值得一提的是各類凝膠技術近年來發展得很快，目前已研制出很多性能優越的新型凝膠。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化學物理穩定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析;而Superose的分離范圍很廣，分辨率較高，可以一次性的分離分子量差異較大的混合物。同時它的機械穩定性也很好。關于各種凝膠產品的詳細情況可以參閱本書附錄以及各個公司的產品目錄。

3.2.5 凝膠的選擇、處理和保存

1. 凝膠的選擇

通過前面的介紹可以看到凝膠的種類、型號很多。不同類型的凝膠在性質以及分離范圍上都有較大的差別，所以在進行凝膠層析實驗時要根據樣品的性質以及分離的要求選擇合適的凝膠，這是影響凝膠層析效果好壞的一個關鍵因素。

一般來講，選擇凝膠首先要根據樣品的情況確定一個合適的分離范圍，根據分離范圍來選擇合適型號的凝膠。一般的凝膠層析實驗可以分為兩類：分組分離(group separations)和分級分離(fractionations)，分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質以及一些注射劑去除大分子熱源物質等等。分級分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開。在分組分離時要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。分級分離時則要根據樣品組分的具體情況來選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應包括所要的各個組分的分子量，另一方面要合適，不能過大。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離;如分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果也不好。

選擇凝膠另外一個方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散現象嚴重;顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當也可以得到滿意的結果。選擇時要依據分離的具體情況而定，例如樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達到分離的目的;如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。由于凝膠一般都比較穩定，所以它在一般的實驗條件下都可以正常的工作。如果實驗條件比較特殊，如在較強的酸堿中進行或含有有機溶劑等等，則要仔細查看凝膠的工作參數，選擇合適的類型的凝膠。

2. 凝膠的處理

凝膠使用前要首先要進行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無水的干膠，所以要計算干膠用量：干膠用量(g)=柱床體積(ml)/ 凝膠的床體積(ml / g)。 由于凝膠處理過程以及實驗過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計算的基礎上再增加10%-20%。

葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠干膠的處理首先是在水中膨化，不同類型的凝膠所需的膨化時間不同。一般吸水率較小的凝膠(即型號較小、排阻極限較小的凝膠)膨化時間較短，在20 ?C條件下需3-4小時;但吸水率較大的凝膠(即型號較大、排阻極限較大的凝膠)膨化時間則較長，20 ?C條件下需十幾個到幾十個小時，如Sephadex G-100以上的干膠膨化時間都要在72小時以上。如果加熱煮沸，則膨化時間會大大縮短，一般在1-5小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。

膨化處理后，要對凝膠進行純化和排除氣泡。純化可以反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質和不均一的細小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。

3. 凝膠的保存

凝膠的保存一般是反復洗滌去除蛋白等雜質，然后加入適當的抗菌劑，通常加入0.02%的疊氮化鈉，4 ?C下保存。如果要較長時間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50%的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復浸泡脫水，至95%乙醇脫水后將凝膠抽干。置于60 ?C烘箱中烘干，即可裝瓶保存。注意膨化的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結構。

3.2.6 凝膠層析的基本操作

凝膠層析的基本操作步驟與前面介紹的柱層析的操作過程基本相似，這里就不再重復了。下面主要介紹凝膠層析操作中應注意的一些具體問題。

1. 層析柱的選擇

層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高;但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25-1:100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。

2. 凝膠柱的鑒定

凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關于填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以采用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用;如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。

3. 洗脫液的選擇

由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格。由于凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。

4. 加樣量

關于加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果;加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大;樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大;一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1%-5%左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10%-25%。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那么加樣量不能超過(Ve1-Ve2)。實際由于樣品擴散，所以加樣量應小于這個值。從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量;如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。

5. 洗脫速度

洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間會大大延長;所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2-10 cm / hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。

總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的分辨率，提高分辨率的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇分辨率高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。但正如前面講過的，各種選擇都有一個限度的問題，超過這個限度可能會產生相反的效果。另外需要提的一點是，實驗時應盡可能的參考相關實驗和文獻以及進行預實驗，以選擇最合適的實驗條件。

3.2.7 凝膠層析的應用

前面介紹了凝膠層析的基本理論以及基本實驗操作，下面簡單介紹一下凝膠層析在生物學方面的應用。

1. 生物大分子的純化

凝膠層析是依據分子量的不同來進行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學活性等優點，使得凝膠層析成為分離純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對于一些大小不同，但理化性質相似的分子，用其它方法較難分開，而凝膠層析無疑是一種合適的方法。例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。

2. 分子量測定

前面已經介紹了，在一定的范圍內，各個組分的Kav以及Ve與其分子量的對數成線性關系。

Kav=-b lg MW+c

Ve=-b’ lg MW+c’

由此通過對已知分子量的標準物質進行洗脫，作出Ve或Kav對分子量對數的標準曲線，然后在相同的條件下測定未知物的Ve或Kav，通過標準曲線即可求出其分子量。凝膠層析測定分子量操作比較簡單，所需樣品量也較少，是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結果的準確性受很多因素影響。由于這種方法假定標準物和樣品與凝膠都沒有吸附作用，所以如果標準物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測量的誤差就會比較大;上面公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對于一些纖維蛋白等細長的形狀的蛋白不成立，所以凝膠層析不能用于測定這類分子的分子量;另外由于糖的水合作用較強，所以用凝膠層析測定糖蛋白時，測定的分子量偏大，而測定鐵蛋白時則發現測定值偏小;還要注意的是標準蛋白和所測定的蛋白都要在凝膠層析的線性范圍之內。

3. 脫鹽及去除小分子雜質

利用凝膠層析進行脫鹽及去除小分子雜質是一種簡便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Sephadex G-25，另外還有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻極限較小的凝膠類型。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價格較貴。

4. 去熱源物質

熱源物質是指微生物產生的某些多糖蛋白復合物等使人體發熱的物質。它們是一類分子量很大的物質，所以可以利用凝膠層析的排阻效應將這些大分子熱源物質與其它相對分子量較小的物質分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質，凝膠層析是一種簡單而有效的方法。

5. 溶液的濃縮

利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮。例如將干燥的Sephadex(粗顆粒)加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質也會滲透進入凝膠孔穴內部，而大分子物質則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變溶液的離子強度和pH值